腸上皮細(xì)胞Syndecan-1在維持腸粘膜屏障中的作用及機(jī)制.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩115頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  本研究通過(guò)利用體外Transwell小室培養(yǎng)法模擬的單層腸上皮模型和體內(nèi)硫酸葡聚糖鈉(Dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)構(gòu)建的腸上皮屏障缺陷小鼠模型,探討了Sdc1與緊密連接蛋白的相互作用在腸上皮屏障功能維護(hù)中的作用;并進(jìn)一步揭示了轉(zhuǎn)錄因子Stat3在這一過(guò)程中的介導(dǎo)作用。
  方法和結(jié)果:
  1.篩選Sdc1不同表達(dá)水平的腸上皮細(xì)胞,構(gòu)建單層腸上皮屏障模型
  采用跨膜電阻

2、儀檢測(cè)上皮跨膜電阻(TEER)來(lái)評(píng)價(jià)上皮屏障的完整性,在大腸桿菌刺激后檢測(cè)細(xì)菌易位,通過(guò)熒光素FITC-dextran(FD4)的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)上皮屏障的通透性。結(jié)果顯示:在Transwell小室底部?jī)?nèi)側(cè)培養(yǎng)細(xì)胞15d之后,TEER值顯著升高,約為300 ohmscm2,證明單層腸上皮屏障形成。大腸桿菌刺激后,以處理前TEER值為對(duì)照,TEER實(shí)測(cè)值的絕對(duì)值及其與處理前TEER值的比值均呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性的減少,而在未被細(xì)菌處理的上皮屏障中

3、TEER值基本維持穩(wěn)定。在Caco-2細(xì)胞構(gòu)建的單層上皮屏障中,TEER值減少更加顯著(F=49.030,P<0.001),大腸桿菌的易位量(t=8.373,P=0.001)和FD4的透過(guò)量(t=9.689,P=0.001)也均較HT29細(xì)胞更加顯著。
  2.Sdc1能緩解大腸桿菌刺激后的屏障功能受損及細(xì)菌易位
  利用慢病毒載體將外源性的Sdc1導(dǎo)入Caco-2細(xì)胞,經(jīng)過(guò)2周左右2μg/mLpuromycin篩選,建立了

4、Sdc1表達(dá)顯著升高的細(xì)胞克隆,通過(guò)熒光定量PCR和Western blot對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示Sdc1在mRNA(t=14.381,P<0.001)和蛋白水平均顯著增加。利用Lipofectmine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Sdc1 siRNA進(jìn)入HT29細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后,Sdc1在mRNA(t=56.292,P<0.001)和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低。
  3.Sdc1能緩解金黃色葡萄球菌刺激后的屏障功能受損及細(xì)菌易位

5、>  利用金黃色葡萄球菌刺激上述已經(jīng)構(gòu)建好的單層上皮屏障。結(jié)果顯示,刺激5h后,與對(duì)照組相比,高表達(dá)Sdc1的Caco-2細(xì)胞的TEER值減低率(F=129.269,P<0.001)和葡萄球菌易位(F=39.479,P<0.001)均顯著減少;而敲低Sdc1表達(dá)的HT29細(xì)胞中,TEER值減低率(F=124.132,P<0.001)和葡萄球菌易位(F=51.965,P=0.001)均顯著增加,均與大腸桿菌刺激屏障后的結(jié)果一致。以上結(jié)果提

6、示Sdc1對(duì)上皮屏障功能的保護(hù)作用并非呈刺激細(xì)菌依賴(lài)性,而可能是一種對(duì)各種細(xì)菌-上皮作用普遍存在的現(xiàn)象。
  4.Sdc1能夠減輕緊密連接蛋白缺陷細(xì)胞的屏障功能受損
  HT29細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA后,ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著下降,若在此基礎(chǔ)上同時(shí)給予Sdc1慢病毒載體處理使Sdc1表達(dá)水平升高,就能夠顯著減弱ZO-1蛋白的下降程度。結(jié)果顯示:在HT29細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA下調(diào)ZO-1蛋白表達(dá)水平后,

7、與對(duì)照組相比,單層上皮屏障的TEER值減低率(F=138.489, P<0.001)、大腸桿菌易位(t=11.624,P<0.001)、FD4透過(guò)值(t=14.802,P<0.001)均顯著升高。若同時(shí)給予Sdc1慢病毒載體處理使ZO-1沉默作用被減輕,上述指標(biāo)升高的程度均有所減少,提示受損的屏障功能被部分恢復(fù),Sdc1可能對(duì)ZO-1蛋白缺陷的細(xì)胞具有保護(hù)作用。
  5.Sdc1能夠緩解小鼠體內(nèi)DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細(xì)菌易位

8、>  利用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的方法構(gòu)建腸粘膜屏障缺陷小鼠模型,通過(guò)尾靜脈注射Sdc1高表達(dá)質(zhì)粒的方法進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染,上調(diào)Sdc1表達(dá),之后評(píng)估腸粘膜緊密連接蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)、組織細(xì)菌易位、腸粘膜組織病理學(xué)變化等相應(yīng)屏障功能的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):PBS對(duì)照組小鼠一般情況及大便性狀均無(wú)顯著變化,DAI評(píng)分為0;組織病理學(xué)檢查和緊密連接超微結(jié)構(gòu)亦無(wú)顯著改變。小鼠飲用DSS溶液3-5天后逐漸出現(xiàn)腹瀉、不同程度的稀便至血便等癥狀,DAI評(píng)分升高(F=5

9、59.328,P<0.001),結(jié)腸縮短。
  提取不同處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾組織樣本的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),計(jì)算其中的細(xì)菌含量。以上結(jié)果提示Sdc1能夠抑制體內(nèi)屏障缺陷模型的細(xì)菌易位。
  6.Sdc1與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細(xì)胞中的表達(dá)及分布相似
  利用免疫熒光染色從細(xì)胞水平觀察Sdc1與ZO-1、occludin的細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sdc1和ZO-1、occludin分

10、布位置相似,均以細(xì)胞膜上分布為主。Caco-2細(xì)胞上調(diào)Sdc1表達(dá)后,Western blot檢測(cè)結(jié)果提示ZO-1和occludin的表達(dá)水平均升高;HT29細(xì)胞敲除Sdc1表達(dá)后,ZO-1和occludin的表達(dá)水平也均有一定程度的降低。
  7.Sdc1通過(guò)激活Stat3信號(hào)通路調(diào)控ZO-1和occludin的表達(dá)
  通過(guò)感染帶有Stat3顯性負(fù)性突變型質(zhì)粒的慢病毒載體阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性后,細(xì)胞中ZO-1和occ

11、ludin的表達(dá)水平均減少(P<0.001)。如果在阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)再感染Sdc1慢病毒載體上調(diào)Sdc1表達(dá),Sdc1對(duì)ZO-1和occludin的表達(dá)調(diào)控作用就被削弱,提示Sdc1是通過(guò)Stat3通路的介導(dǎo)從而發(fā)揮對(duì)ZO-1和occludin的調(diào)控作用的。
  8.Stat3信號(hào)通路參與Sdc1對(duì)腸上皮屏障功能的維護(hù)
  在細(xì)胞中阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)上調(diào)Sdc1的表達(dá)水平,檢測(cè)Sdc1表達(dá)水平改變前后腸上

12、皮單層屏障模型的功能變化。結(jié)果提示:單獨(dú)阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性,單層上皮屏障功能受損,表現(xiàn)為T(mén)EER值下降(F=83.270,P<0.001),大腸桿菌易位(t=3.954,P=0.017)及FD4透過(guò)增加(t=11.143,P<0.001)。盡管Sdc1能夠維持細(xì)胞的TEER值在較高水平,抑制細(xì)菌易位和FD4的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),但當(dāng)Stat3通路被阻斷時(shí),Sdc1的上述保護(hù)作用就被削弱。
  9.Stat3能直接結(jié)合ZO-1和occl

13、udin的啟動(dòng)子
  生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn):在人類(lèi)ZO-1和occludin基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約10 kb以?xún)?nèi)的DNA序列中,可以找到多個(gè)類(lèi)似Stat3結(jié)合核心序列(TTCCGGAA)的DNA序列,被認(rèn)為是潛在的Stat3的DNA結(jié)合位點(diǎn),隨后利用ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否位于ZO-1或occludin的啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)果提示:在ZO-1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-199~-208 bp、-394~-404 bp處,occludin轉(zhuǎn)錄起始位

14、點(diǎn)上游-4458~-4469 bp、-5385~-5394 bp、-7056~-7066 bp處分別找到若干個(gè)與Stat3分子DNA結(jié)合序列最相似的序列,ChIP-PCR顯示ZO-1和occludin基因的啟動(dòng)子序列通過(guò)Stat3-ChIP得到了富集(P<0.05),證明Stat3可以與ZO-1和occludin的啟動(dòng)子結(jié)合。當(dāng)Caco-2細(xì)胞高表達(dá)Sdc1時(shí),Stat3向ZO-1和occludin啟動(dòng)子區(qū)域的募集顯著增加(P<0.01

15、)。在HT29細(xì)胞中敲除Sdc1后,Stat3的募集相對(duì)減少(P<0.01)。這些結(jié)果表明,Sdc1能夠激活Stat3分子發(fā)生磷酸化,Stat3能夠直接靶向結(jié)合ZO-1和occludin的啟動(dòng)子,三者表達(dá)水平呈正相關(guān)。
  10.ZO-1與occludin具有相互作用,反饋調(diào)節(jié)Sdc1表達(dá)
  Co-IP實(shí)驗(yàn)提示免疫沉淀的ZO-1復(fù)合體中可以檢測(cè)到occludin蛋白的存在,同樣,在免疫沉淀的occludin復(fù)合體中也可以檢

16、測(cè)到ZO-1蛋白的存在;而ZO-1和occludin與作為陰性對(duì)照的IgG蛋白不發(fā)生任何結(jié)合作用,表明ZO-1和occludin二者能夠發(fā)生相互作用,構(gòu)成免疫復(fù)合體。在HT29細(xì)胞中,敲除ZO-1或occludin蛋白,Sdc1的表達(dá)水平呈反饋性增加。提示三者可能構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路,共同參與對(duì)腸上皮屏障功能的維持。
  結(jié)論:
  1、Sdc1對(duì)腸上皮屏障的維護(hù)具有保護(hù)作用,表現(xiàn)為能夠顯著穩(wěn)定上皮的完整性、抑制細(xì)菌易位和降低跨膜

17、轉(zhuǎn)運(yùn)的通透性;
  2、Sdc1能夠在體外提高緊密連接蛋白缺陷細(xì)胞的單層上皮屏障功能;
  3、Sdc1能夠在體內(nèi)緩解DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細(xì)菌易位;
  4、Sdc1與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細(xì)胞中的表達(dá)同步、分布相似;
  5、Sdc1能夠激活Stat3信號(hào)通路,磷酸化的Stat3直接結(jié)合ZO-1和occludin的啟動(dòng)子區(qū)域,調(diào)控ZO-1和occludin的轉(zhuǎn)錄,從而參與Sdc1對(duì)屏障功能的

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論