C-EBP-α基因誘導肝細胞和肝星狀細胞凋亡差異的體內(nèi)外研究及乙?；{(diào)控探討.pdf

1、肝纖維化及其終末期疾病肝硬化目前仍是困擾全球的健康問題。它可以由多種疾病引起，最終可導致肝功能衰竭和門靜脈高壓，目前尚無有效治療方法，終末期多需要肝臟移植。因此，了解其發(fā)病機制對其預防和治療十分重要。
　　 目前認為肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。靜止狀態(tài)下HSCs為一種儲存維生素A和脂類的非實質(zhì)細胞，可以維持正常情況下肝臟的基底膜基質(zhì)平衡。肝臟損傷可以誘導

2、HSCs激活，使其失去儲存脂類的特征，增生并合成富含Ⅰ型膠原纖維的纖維基質(zhì)。激活的HSCs還可以釋放炎癥因子和多種致纖維化的細胞因子，以及組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)，改變細胞外基質(zhì)平衡，促進膠原纖維沉積，最終導致肝纖維化。
　　 長久以來一直認為肝纖維化是不可逆轉(zhuǎn)的，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，其中心環(huán)節(jié)是激活的HSCs發(fā)生凋亡

3、。因此，如何促使激活的HSCs發(fā)生凋亡成為防治肝纖維化的重要目標。
　　 目前認為HSCs的分化類似于脂肪細胞。因而一些特異性調(diào)控脂肪細胞分化的基因也可能調(diào)控HSCs的分化。CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancerbinding protein，C/EBP)在脂肪分化中起到重要作用。尤其是C/EBP-α可以調(diào)控前脂肪細胞的成熟和分化。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)C/EBP-α可以在體內(nèi)和體外誘導HSCs發(fā)生凋亡。但是C

4、/EBP-α對肝細胞有何作用，以及其對肝細胞和HSCs的作用有無差異仍知之甚少。因此，我們采用表達C/EBP-α的腺病毒載體(Ad-C/EBP-α)在體內(nèi)和體外檢測C/EBP-α誘導肝細胞和HSCs凋亡的差異。此外，我們進一步研究了HSCs中C/EBP-α是否受乙?；{(diào)控，旨在了解乙?；{(diào)控機制在C/EBP-α誘導HSCs凋亡中的作用，以期進一步了解肝纖維化的發(fā)病機制。
　　 第一部分腺病毒介導的C/EBP-α基因誘導肝細胞和H

5、SCs凋亡差異的體外研究
　　 目的:檢測腺病毒介導的C/EBP-α基因誘導肝細胞和HSCs凋亡有無差異。
　　 方法:構(gòu)建腺病毒介導的C/EBP-α基因Ad-C/EBP-α，分別用50，100，200MOIAd-C/EBP-α感染大鼠肝細胞系BRL-3A和HSCs細胞系HSC-T6，48小時后采用DNA ladder電泳、流式細胞儀、AnnexinV/PI染色檢測兩種細胞凋亡有無差異，以及Western Blot方法檢

6、測分析各種Caspases包括Caspase3，8，9，12的表達情況，探討C/EBP-α誘導兩種細胞的凋亡途徑有無差異。
　　 結(jié)果：HSCs和肝細胞對C/EBP-α誘導的凋亡有顯著差異。DNA ladder結(jié)果顯示HSCs從50MOI開始就產(chǎn)生DNA ladder現(xiàn)象，而肝細胞直到200MOI也沒有發(fā)生凋亡。流式細胞分析和AnnexinV/PI染色結(jié)果顯示HSCs從50MOI時就發(fā)生顯著凋亡，并呈劑量依賴性增高。而肝細胞無明

7、顯變化。Western Blot法結(jié)果顯示Ad-C/EBP-α感染后，50MOI時可以引起HSCs發(fā)生凋亡，而200MOI時才會引起肝細胞發(fā)生凋亡。Caspase9參與了兩種細胞的凋亡途徑，而Caspase8，12未參與Ad-C/EBP-α誘導的兩種細胞的凋亡途徑。Caspase9抑制劑可以顯著抑制HSCs的凋亡，但僅部分抑制肝細胞的凋亡。
　　 結(jié)論：Ad-C/EBP-α誘導肝細胞和HSCs發(fā)生凋亡在劑量上有顯著差異，但都是與

8、線粒體途徑有關(guān)。
　　 第二部分腺病毒介導的C/EBP-α基因誘導肝細胞和HSCs凋亡差異的體內(nèi)研究
　　 目的:檢測腺病毒介導的C/EBP-α基因?qū)Cl4誘導的小鼠肝纖維化的作用。
　　 方法:采用腹腔注射CCl4建立Balb/c小鼠的肝纖維化模型。從造模第1周(早期預防組)或第6周(晚期治療組)通過尾靜脈注射Ad-C/EBP-α，10周后處死動物。采用免疫組織化學方法和Western Blot檢測C/EBP

9、-α在肝臟內(nèi)的表達。透射電鏡觀察血竇內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。眼球采血檢測小鼠血清白蛋白、總蛋白、ALT、γ-GT的表達。常規(guī)HE染色和天狼猩紅染色以及肝組織羥脯氨酸含量測定來檢測不同實驗組肝纖維化的程度；采用免疫組織化學染色檢測肝組織α-SMA、PCNA表達變化。TUNEL法柃測肝細胞和HSCs的凋亡情況。
　　 結(jié)果:尾靜脈注射Ad-C/EBP-α后小鼠肝臟石蠟切片中C/EBP-α表達遠遠高于對照組，且主要位于HSCs內(nèi)；透射電鏡可見肝竇內(nèi)

10、皮窗孔逐漸消失，內(nèi)皮下連續(xù)性基底膜形成，治療后好轉(zhuǎn)。常規(guī)HE染色、天狼猩紅染色和肝組織羥脯氨酸含量測定證實無論是預防組還是治療組，膠原纖維含量均顯著低于對照組；血清學指標顯示注射Ad-C/EBP-α后，γ-GT表達量顯著下降，其他指標各組之間無明顯差異。免疫組織化學染色顯示Ad-C/EBP-α注射組肝組織內(nèi)α-SMA陽性細胞的個數(shù)顯著減少，TUNEL檢測顯示凋亡的主要是HSCs。
　　 結(jié)論:體內(nèi)感染Ad-C/EBP-α基因能有

11、效緩解CCh誘導的小鼠肝纖維化，大大減少肝纖維化模型肝組織內(nèi)α-SMA陽性細胞的個數(shù)，并且促進HSCs的凋亡，而對肝細胞無明顯促凋亡作用，對肝臟功能亦無明顯損傷。
　　 第三部分 C/EBP-α基因誘導大鼠HSCs凋亡的乙?；{(diào)控的探討
　　 目的:研究乙?；瘜/EBP-α誘導HSCs凋亡的作用有無影響，以及其可能的機制。
　　 方法:選取不同HDACI包括TSA，SAHA以及尼克酰胺，采用不同劑量對大鼠肝細胞

12、系BRL-3A和HSCs系HSC-T6進行處理，用CCK-8法檢測其對肝細胞和HSCs生長抑制率的影響；Western Blot檢測不同劑量的TSA聯(lián)合Ad-C/EBP-α同時處理HSC-T6后Caspase3，8，9，12表達情況，Realtime RT-PCR以及WesternBlot檢測不同時間點TSA對HSC-T6內(nèi)源性C/EBP-α mRNA和蛋白的表達影響，以及組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HATs)TIP60表達的差異。應用免疫共沉

13、淀方法檢測C/EBP-α的乙?；揭约癈/EBP-α和TIP60有無相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1)TSA，SAHA和尼克酰胺三種HDACI中TSA對。HSCs的增生抑制效果遠遠高于肝細胞，而SAHA和尼克酰胺則相反。
　　 2)TSA本身可以誘導HSCs發(fā)生凋亡，并可以增強C/EBP-α誘導HSCs的凋亡作用。
　　 3)HSC-T6經(jīng)TSA處理后，乙?；皆龈?，C/EBP-α mRNA表達量不