靶向C-EBp-β基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖、凋亡、遷移的影響.pdf

1、研究目的:
　　構(gòu)建針對(duì)C/EBP-β慢病毒質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，篩選并培養(yǎng)穩(wěn)定干擾C/EBP-β表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞株;進(jìn)一步研究沉默C/EBP-β對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響。
　　研究方法:
　　1.利用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)C/EBP-β及eGFP（對(duì)照）shRNA序列，分別裝入pLKO.1-TRC質(zhì)粒，進(jìn)行慢病毒包裝，構(gòu)建針對(duì)

2、C/EBP-β和eGFP的慢病毒質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并測(cè)序。
　　2.將已包裝成功的sh-C/EBP-β和sh-eGFP慢病毒轉(zhuǎn)染SMMC-7721，嘌呤霉素篩選并培養(yǎng)針對(duì)C/EBP-β穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β及針對(duì)eGFP穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP。Western Blot分別檢測(cè)兩組細(xì)胞C/EBP-β的表達(dá)情況。
　　3.CCK8法檢測(cè)沉默C/EBP-

3、β基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞增殖的影響。
　　4.Western Blot檢測(cè)沉默C/EBP-β基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1表達(dá)的影響。
　　5.Western Blot檢測(cè)沉默C/EBP-β基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2及凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)影響。
　　6.劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默C/EBP-β基因?qū)MMC-7721遷移能力的影響。<

4、br>　　研究結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)包裝的sh-C/EBP-β和sh-eGFP慢病毒具有感染肝癌SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞系能力，獲得了針對(duì)C/EBP-β基因的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β，針對(duì)eGFP基因的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP。
　　2.Western Blot檢測(cè)顯示:與對(duì)照組SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，pLKO-sh-C/E

5、BP-β慢病毒可顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)C/EBP-β的表達(dá)（P＜0.05）。
　　3.CCK8法檢測(cè)顯示:與對(duì)照組SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，實(shí)驗(yàn)組SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β的增殖速度顯著提高(相對(duì)增值率136.8％，P＜0.05)。
　　4.Western Blot檢測(cè)顯示:與對(duì)照組SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，實(shí)驗(yàn)組SMMC-7721-pLKO-

6、sh-C/EBP-β的周期蛋白Cyclin B1表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　5.Western Blot檢測(cè)顯示:與對(duì)照組SMMC-7721-pLKO-sh-eGFP相比，實(shí)驗(yàn)組SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β促進(jìn)了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)(P＜0.05)并抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)(P＜0.05)。
　　6.劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組SMMC-7721-pLKO-sh-eGF

7、P相比，實(shí)驗(yàn)組SMMC-7721-pLKO-sh-C/EBP-β的遷移能力明顯增強(qiáng)，遷移抑制率為-292.3％（P＜0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pLKO-sh-C/EBP-β載體，并篩選出沉默C/EBP-β的穩(wěn)定干擾細(xì)胞株;沉默C/EBP-β對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖、遷移有促進(jìn)作用，對(duì)其凋亡有抑制作用，且其細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1表達(dá)升高。為初步闡明C/EBP-β在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的角色