肝細(xì)胞核因子4誘導(dǎo)肝細(xì)胞功能的體外和體內(nèi)研究.pdf

1、目的：首先比較不同肝細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)以及肝腫瘤細(xì)胞．HNF4α基因和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)情況，然后選擇HNF4α作為外源目的基因，利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)HNF4α的重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdHNF4α，通過(guò)病毒體外感染人肝腫瘤細(xì)胞株(HepG2和Hep3B)以及小鼠ES細(xì)胞，上調(diào)目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，分別觀察HNF4α基因上調(diào)對(duì)其生物學(xué)功能的影響；并應(yīng)用HNF4α基因修飾

2、HepG2細(xì)胞治療急性肝功能衰竭小鼠，初步觀察小鼠生存率和肝功能改善情況。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、比較不同肝細(xì)胞、肝腫瘤細(xì)胞以及ES細(xì)胞HNF4α和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)人正常成熟肝細(xì)胞、人肝腫瘤細(xì)胞株以及人胎肝細(xì)胞株HNF4α基因和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)；同法檢測(cè)小鼠正常成熟肝細(xì)胞、不同發(fā)育階段胎肝細(xì)胞、小鼠ES細(xì)胞HNF4α基因和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)。 二、重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdHNF4α

3、構(gòu)建及鑒定將pAdTrack-CMV與獲得的HNF4α cDNA片段均經(jīng)BglⅡ、EcoRⅤ酶切后連接，獲得質(zhì)粒pAdTrack-CMV-HNF4α，將Pme Ⅰ酶切線性化的pAdTrack-CMV-HNF4α與pAdEasy-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌同源重組，PacⅠ酶切篩選出pAdHNF4α，并測(cè)序驗(yàn)證目的基因序列的正確性。PacⅠ酶切線性化的pAdHNF4α轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，反復(fù)感染、凍融293細(xì)胞，獲得AdHNF4α，以

4、同樣方法獲得對(duì)照病毒AdGFP。將AdHNF4α體外感染胎肝細(xì)胞株L02，以RT-PCR和Western blot檢測(cè)HNF4α在肝細(xì)胞中的表達(dá)。 三、外源導(dǎo)入HNF4α對(duì)人肝腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性影響人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2和Hep3B均以5×10<'5>/皿接種于六孔板，分別將病毒以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)40、50感染細(xì)胞，24 h后更換含10％胎牛血清的新鮮DMEM培液，3 d后

5、觀察GFP表達(dá)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)HNF4α表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)，流式細(xì)胞儀測(cè)定肝腫瘤細(xì)胞凋亡率。 四、外源導(dǎo)入HNF4α對(duì)小鼠ES細(xì)胞生物學(xué)特性影響首先制備小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞(primary mouse embryonic fibroblast，PMEF)滋養(yǎng)層，將小鼠ES細(xì)胞接種于其上進(jìn)行培養(yǎng)和傳代；將ES細(xì)胞以密度為2x10<'5>/ml接種于培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，第5 d

6、將形成的胚體以30～40個(gè)/皿接種于0.1％明膠包被過(guò)的35 mm組織培養(yǎng)皿使其貼壁誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)液中分別加入AdHNF4α或?qū)φ詹《続dGFP，在分化過(guò)程中觀察GFP，并添加病毒維持HNF4α表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CK8、CK18、AFP以及ALB的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)，過(guò)碘酸-Schiff氏法(Periodic Acid-Shift，PAS)法檢測(cè)糖原合成，吲哚氰綠(Indocyanine Green，I

7、CG)吸收染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞代謝ICG功能。 五、HNF4α基因修飾的移植肝細(xì)胞治療小鼠急性肝功能衰竭將HNF4α基因修飾的HepG2(HepG2-HNF4α)以4×10<'6>/只通過(guò)尾靜脈導(dǎo)入CCl<,4>誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭小鼠體內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清總膽紅素和血糖，觀察小鼠的一般情況和生存率等指標(biāo)，評(píng)估HNF4α基因修飾的HepG2對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝功能衰竭的治療效果。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)

8、行分析，灰度比值采用One-Way ANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有非常顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、在不同分化水平的肝細(xì)胞中HNF4α表達(dá)有明顯差異。 1.RT-PCR檢測(cè)人正常成熟肝細(xì)胞、人肝腫瘤細(xì)胞株Huh-7、Hep3B、HepG2、人胎肝細(xì)胞株L02以及WRL-68的HNF4α基因和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在不同分化水平的肝細(xì)胞中

9、HNF4α表達(dá)有明顯差異，在正常成熟的肝細(xì)胞中表達(dá)最高，其表達(dá)量約為肝腫瘤細(xì)胞株Huh-7表達(dá)量的4倍、Hep3B表達(dá)量的10倍以及HepG2表達(dá)量的2.3倍(P<0.05)，而在永生化的胚胎肝細(xì)胞株L02和WRL-68中無(wú)明顯表達(dá)；同時(shí)肝細(xì)胞的重要功能基因如載脂蛋白CⅢ(apolipoprotein cⅢ，APOCⅢ)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-P)、白蛋白(albumin，ALB)、谷胺

10、酰氨合成酶(glutaminesynthetase，GS)、細(xì)胞色素P450家族1α2(cytochrome P450 1α2，CYP1α2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)以及甲狀腺激素結(jié)合蛋白(transthyretin，TTR)的表達(dá)與HNF4α基因的表達(dá)密切相關(guān)，這些基因在成熟肝細(xì)胞中的表達(dá)較肝腫瘤細(xì)胞株明顯增多，而胚胎肝細(xì)胞株中未見明顯表達(dá)。 2.

11、RT-PCR比較小鼠正常成熟肝細(xì)胞、ES細(xì)胞、胚齡13 d胎肝細(xì)胞、胚齡15 d胎肝細(xì)胞、胚齡19 d胎肝細(xì)胞和出生后1 d小鼠胎肝細(xì)胞的HNF4α以及肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：隨著分化水平的提高，HNF4α表達(dá)逐漸增加，同時(shí)肝細(xì)胞相關(guān)的重要功能基因如CYP1α2、ALB、G-6-P、苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)、PEPCK、TTR以及GS等表達(dá)也相應(yīng)逐漸上調(diào)。 二、

12、AdHNF4α的構(gòu)建及鑒定。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得1425 bp人HNF4α cDNA片段，測(cè)序鑒定并作同源序列分析加以證實(shí)；體外連接獲得穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-HNF4α，同源重組后篩選獲得pAdHNF4α；經(jīng)293細(xì)胞包裝并反復(fù)感染、凍融，獲得1×10<'10>表達(dá)形成單位/ml(efu/ml)滴度的AdHNF4α；AdHNF4α體外感染肝細(xì)胞株L02 3 d后，RT-PCR和Western blot檢測(cè)HNF4α在轉(zhuǎn)錄和翻譯

13、水平上的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，證實(shí)病毒構(gòu)建成功并能在細(xì)胞內(nèi)維持HNF4α高效表達(dá)。 三、外源導(dǎo)入HNF4α基因?qū)θ烁文[瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 1.將AdHNF4α以MOI 40、50分別感染細(xì)胞HepG2和Hep3B 3 d后，熒光顯微鏡下可見90％以上的細(xì)胞表達(dá)GFP；RT-PCR與Western blot均檢測(cè)出HNF4α在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)。 2.RT-PCR顯示，導(dǎo)入HNF4α基因明顯提高肝腫瘤細(xì)胞CYP

14、1 α 2、G-6-P、GS、PEPCK以及APOCⅢ等肝細(xì)胞相關(guān)功能基因mRNA表達(dá)，其中G-6-PmRNA表達(dá)上調(diào)近50倍，而ALB、TTR表達(dá)未見明顯變化，AFP表達(dá)則明顯下調(diào)。 3.流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：上調(diào)肝腫瘤細(xì)胞HNF4α表達(dá)后細(xì)胞的凋亡率分別增加約3.0倍(Hep3B中AdGFP組凋亡率10.1％，AdHNF4α組29.8％，P<0.05)和4.5倍(HepG2中AdGFP組凋亡率6.5％，AdHNF4α組29.2

15、％，P<0.05)。 四、外源導(dǎo)入HNF4α對(duì)小鼠ES細(xì)胞生物學(xué)特性影響。 1.將小鼠ES細(xì)胞株ES-D3復(fù)蘇后接種于鋪有MEF滋養(yǎng)層細(xì)胞的組織培養(yǎng)皿中，每天換液，2～3 d可見到表面光滑、邊界清楚的細(xì)胞克隆，懸浮培養(yǎng)形成胚體。 2.將第5 d的胚體接種于0.1％明膠包被過(guò)的組織培養(yǎng)皿，使其貼壁誘導(dǎo)分化，并在培養(yǎng)液中加入AdHNF4α感染3 d后，熒光顯微鏡下可見克隆周邊分化的細(xì)胞90％以上均表達(dá)GFP； RT-

16、PCR與免疫細(xì)胞化學(xué)法均檢測(cè)出HNF4α在小鼠ES細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)，HNF4α蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，AdHNF4α感染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早在第8 d即有CK8、CK18以及AFP大量表達(dá)，且較對(duì)照組(陰性對(duì)照組和AdGFP感染組)明顯增強(qiáng)；感染組細(xì)胞ALB于第15 d開始表達(dá)，較對(duì)照組顯著增加。 結(jié)論： 1.HNF4α表達(dá)與肝細(xì)胞分化水平明顯相關(guān)。隨著分化水平的提高，其表達(dá)逐漸增加，

17、在正常成熟的肝細(xì)胞中表達(dá)最高，同時(shí)肝細(xì)胞生物學(xué)功能基因表達(dá)水平與HNF4α的表達(dá)密切相關(guān)。 2.利用AdEasy<'TM>腺病毒載體可將外源HNF4α基因?qū)敫文[瘤細(xì)胞并維持高效表達(dá)，并增強(qiáng)正常肝細(xì)胞重要功能基因表達(dá)，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性明顯改善。 3．通過(guò)上調(diào)小鼠ES細(xì)胞HNF4α表達(dá)，可明顯提高正常肝細(xì)胞如CYP1α2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表達(dá)，糖原合成和ICG代謝功能顯著增強(qiáng)，ES細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的能