幽門(mén)螺桿菌cagM基因的克隆表達(dá)及信息學(xué)分析.pdf

1、目的：構(gòu)建表達(dá)幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)NCTC11637Ⅳ型分泌系統(tǒng)cagM(HP0537)全長(zhǎng)編碼基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化CagM蛋白，分析其抗原性并制備抗體，用生物信息學(xué)方法分析其理化特征，并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究CagM蛋白在Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的作用和幽門(mén)螺桿菌致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：根據(jù)GenBank中已報(bào)道的H.pylori26695的全基因組序列，用Pr

2、imer5.0設(shè)計(jì)cagM引物，并在引物中加入限制酶酶切位點(diǎn)，以幽門(mén)螺桿菌NCTC11637為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的片段；將其進(jìn)行T-A克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)DH5α，雙酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列測(cè)定；將測(cè)序結(jié)果提交GenBank，獲得基因登錄號(hào)，用序列比對(duì)分析cagM基因的同源性，以及其氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、親水性、疏水性、抗原性等理化

3、特性；再將其定向插入pET-28a(+)載體，構(gòu)建pET-28a(+)-cagM表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli BL21，通過(guò)卡那霉素抗性篩選和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆；IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，并優(yōu)化其表達(dá)條件(誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度)，表達(dá)的CagM蛋白用Ni2+-NTA樹(shù)脂進(jìn)行純化；純化后的重組蛋白免疫家兔，制備抗CagM多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELI

4、SA)檢測(cè)血清抗體效價(jià)；用生物數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)軟件分析CagM蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位和蛋白家族，以及預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白功能位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.H.pylori NCTC11637 cagM測(cè)序結(jié)果表明cagM基因全長(zhǎng)1131bp(基因庫(kù)登錄號(hào)為GU269568)，編碼376個(gè)氨基酸，與GenBank中已知其他菌株基因序列的核苷酸同源性為96％～99％，氨基酸同源性為98％～99％。

5、r>　　 2.軟件分析：CagM蛋白中65個(gè)堿性氨基酸，52個(gè)酸性氨基酸，126個(gè)疏水性氨基酸，111個(gè)非極性氨基酸，分子量約為43.76199kD，等電點(diǎn)為9.3，熔點(diǎn)為78.56℃。CagM蛋白有多個(gè)疏水性區(qū)域和多個(gè)親水性區(qū)域，其中親水性區(qū)域主要分布于N端，CagM抗原性較強(qiáng)。
　　 3.成功構(gòu)建pET-28a(+)-cagM原核表達(dá)載體，確定IPTG終濃度1.0mmol/L，溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間4h為最佳誘導(dǎo)條件，經(jīng)Ni

6、2+-NTA純化后的CagM重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為43.7kDa，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。CagM重組蛋白免疫家兔，獲得抗CagM多克隆抗體，其效價(jià)為1:1.6×105。
　　 4.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：CagM蛋白N端20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)在第21個(gè)氨基酸，亞細(xì)胞定位于細(xì)菌周質(zhì)空間，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占60％以上，無(wú)規(guī)則卷曲占10％左右，β折疊和轉(zhuǎn)角各占一小部分，三級(jí)結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象為一個(gè)馬鞍狀，由N端和C端的球狀部分和中

7、間的單鏈組成。
　　 5.CagM屬于蛋白水解酶家族，有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是多種激酶的底物，有糖基化位點(diǎn)和豆蔻化位點(diǎn)，通過(guò)翻譯后剪切修飾，形成有功能蛋白，在細(xì)菌周質(zhì)空間行使信號(hào)傳遞和集裝Ⅳ型分泌系統(tǒng)中其他蛋白功能。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功克隆了cagM基因，是H.pylori cag PAI編碼的TFSS的重要基因之一。
　　 2.成功構(gòu)建了cagM基因的原核表達(dá)載體，獲得了CagM重組蛋白，并制備了