在人胚腎293T和惡性胃癌MGC-803細胞系中Smad-4和TGF-β對抑癌基因PTEN的調(diào)控作用.pdf

1、PTEN（與細胞骨架張力蛋白同源在腫瘤第10號染色體有缺失的磷酸脂酶基因），也叫MMAC1（在多個進展期腫瘤中均有突變的基因），是一種抑癌基因，位于染色體10q23區(qū)，負責編碼磷酸酯酶。已發(fā)現(xiàn)在多種人類癌癥中 PTEN抑癌基因的缺失。在胃癌的PTEN基因丟失，但并未有報道此基因有高頻突變。另一方面，Smad-4是唯一共同通路型Smad(Co-Smad)蛋白，有研究認為Smad-4作為一個抑癌基因通過TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）來介導(dǎo)相關(guān)

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad-4被發(fā)現(xiàn)在胃癌等多種癌癥中丟失或發(fā)生突變。
　　在本論文中，研究了在人胚腎293T和惡性胃癌MGC-803兩種細胞系中，Smad-4和TGF-β對抑癌基因PTEN表達的調(diào)控作用。
　　通過熒光素酶雙報告基因分析，經(jīng)轉(zhuǎn)染過表達Smad-4的293T細胞中PTEN基因的啟動子活性顯著增加，表明PTEN啟動區(qū)和SMAD-4蛋白之間存在一定的相互作用。
　　經(jīng)轉(zhuǎn)染帶有Smad-4過表達質(zhì)粒的人胚腎293T細

3、胞，在有或無TGF-β1的情況下，都表現(xiàn)出上調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達水平;然而，轉(zhuǎn)染Smad-4并同時用TGF-β1處理的細胞中PTEN才得以最終表達。同時，通過siRNA技術(shù)干擾Smad-4的表達，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出下調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達水平。
　　染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)的結(jié)果顯示Smad-4蛋白與PTEN啟動子之間有三個結(jié)合作用位點。
　　另外，發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中Smad-4和TGF-β的抑癌作用與正常細胞中有

4、所不同，正如很多研究中都提到過關(guān)于不同細胞系中TGF-β或Smad-4對PTEN表達調(diào)控的爭議問題。對于轉(zhuǎn)染有Smad-4表達質(zhì)粒的人惡性胃癌MGC-803細胞，在有或無TGF-β1的情況下，均導(dǎo)致PTEN的mRNA和蛋白表達水平下調(diào);轉(zhuǎn)染Smad-4并同時用TGF-β處理的細胞中PTEN的表達減少。
　　許多之前的報告中提到活性RAS致癌基因及其下游在胃癌發(fā)生中的作用。本文中，先用MEK抑制劑PD98059處理MGC-803細胞

5、，之后再轉(zhuǎn)染Smad-4并施加TGF-β1信號。蛋白免疫印跡和RT-PCR實驗結(jié)果表明:細胞再次開啟了PTEN基因的表達;同時經(jīng)Smad-4轉(zhuǎn)染和TGF-β信號處理，PTEN得以最大限度表達。
　　數(shù)據(jù)顯示RAS/ERK信號通路在腫瘤細胞中處于活化狀態(tài)，而MEK抑制劑PD98059的使用又使其被抑制。此外，分別檢測了MGC-803細胞的胞質(zhì)和核片段中Smad-4的含量，結(jié)果顯示經(jīng)MEK抑制劑處理同時施加TGF-β1信號的細胞中Sm

6、ad-4蛋白的位置改變進入到細胞核中。因此，抑制RAS/ERK信號通路恢復(fù)了TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而實現(xiàn)Smad-4促進PTEN的表達抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)化為表達上調(diào)。
　　綜上，在正常293T細胞中Smad-4通過TGF-β信號誘導(dǎo)PTEN的表達。然而這種調(diào)控作用在胃癌MGC-803細胞中卻是對PTEN表達的下調(diào)或是抑制作用，這可能是由于活化的RAS/ERK信號通路阻止了Smad-4的轉(zhuǎn)運入核進而影響對PTEN的誘導(dǎo)表達。再通過抑制RA