陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM作為神經(jīng)母瘤細(xì)胞基因載體的評(píng)估.pdf

1、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）炎癥性脫髓鞘的自身免疫性疾病，其特征是髓鞘特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫攻擊而引起的髓鞘脫失，局部 T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、軸突損害及神經(jīng)功能喪失。
　　MS永久的神經(jīng)功能缺失與神經(jīng)元丟失及軸突損傷有關(guān)。研究表明，MS炎癥機(jī)制除可導(dǎo)致脫髓鞘和軸突損傷外，其自身免疫細(xì)胞同樣具有神經(jīng)保護(hù)特性，部分由其釋放的神經(jīng)營(yíng)

2、養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)所介導(dǎo)。
　　文獻(xiàn)報(bào)道給予體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞加入BDNF主要促其向神經(jīng)元方向分化。但目前BDNF仍未能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療中應(yīng)用，因?yàn)锽DNF是天然的蛋白分子，難以通過(guò)血腦屏障，如何把足量的BDNF傳送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的適當(dāng)部位仍存在困難。而基因轉(zhuǎn)染是目前能提供長(zhǎng)期療效的治療方法。此技術(shù)的關(guān)鍵步驟就是通過(guò)載體將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。而且可根據(jù)需要

3、修飾基因載體，使其可通過(guò)血腦屏障。
　　基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程需要高效、高安全性的載體。目前應(yīng)用于基因治療研究的基因轉(zhuǎn)移載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。
　　常用的病毒載體，雖經(jīng)遺傳工程改造，去除了病原性而保留了基因轉(zhuǎn)染效能，但制備困難、目的基因插入長(zhǎng)度受限，還存在潛在的免疫反應(yīng)和生物安全等問(wèn)題，很大程度限制了其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。故人們一直致力尋找新的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體。
　　非病毒載體主要是合成的帶有正電的陽(yáng)離子基因載體，

4、合成載體的優(yōu)點(diǎn)是安全性高、適應(yīng)性好、易于改造。而其中的新型陽(yáng)離子聚合物是目前生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)包括：
　　(1)無(wú)免疫原性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)；
　　(2)通過(guò)控制粒徑尺寸和表面性質(zhì)可控制載體的生理行為；
　　(3)可根據(jù)需要靈活設(shè)計(jì)分子結(jié)構(gòu)；
　　(4)遺傳物質(zhì)的釋放可做到由聚合物基質(zhì)的降解速率決定。
　　陽(yáng)離子聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白

5、多糖相互作用，并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。
　　中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院高分子研究所張黎明教授課題組通過(guò)分子設(shè)計(jì)合成的納米材料，星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM具有以下優(yōu)點(diǎn)：
　　(1)具有良好的水溶性和生物相容性；
　　(2)可與DNA形成納米粒；
　　(3)表面大量的陽(yáng)離子基團(tuán)，提供了進(jìn)一步功能化的可能。但該聚合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生物安全性、對(duì)質(zhì)粒DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的能力如何還不明確。β-CD-PAMA

6、M化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
　　因此，我們化學(xué)合成星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM，研究其負(fù)載質(zhì)粒DNA能力，并檢測(cè)其形成納米復(fù)合體的粒徑、zeta-電位、形態(tài)和結(jié)構(gòu)；同時(shí)在體外檢測(cè)了其細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)一步研究了血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　本課題內(nèi)容分為兩部分：
　　1.星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM與DNA形成復(fù)合物后的理化性質(zhì)；
　　2.星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM作為質(zhì)粒DNA傳輸載體的體外實(shí)

7、驗(yàn)研究；
　　第1章星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM與DNA形成復(fù)合物后的理化性質(zhì)
　　目的：
　　檢測(cè)星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM與DNA形成復(fù)合物后的理化特性，并進(jìn)一步研究其負(fù)載質(zhì)粒DNA的能力。
　　方法：
　　按照一定的N/P比(N/P比是指陽(yáng)離子聚合物中的NH4+與DNA中的PO3-摩爾比例)，陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM與 DNA均勻混合形成復(fù)合物后，在ZetaPALS-電位分析

8、儀上測(cè)定納米復(fù)合體的粒徑和表面電荷。電子透射顯微鏡觀察β-CD-PAMAM與DNA在N/P為10形成納米復(fù)合體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)研究β-CD-PAMAM負(fù)載質(zhì)粒DNA的能力。
　　結(jié)果：
　　1.納米材料復(fù)合體的粒徑和zeta-電位
　　β-CD-PAMAM/ DNA納米復(fù)合體粒徑隨著N/P從1到30的增大而減小，大約在100-200nm之間；β-CD-PAMAM/DNA納米復(fù)合體表面電荷隨著N/P

9、從1到30的增大而增大，從此結(jié)果看β-CD-PAMAM/DNA結(jié)合穩(wěn)定。
　　2.納米材料復(fù)合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
　　通過(guò)電子透射顯微鏡觀察β-CD-PAMAM/pEGFP-N3在N/P比為10形成的納米復(fù)合體大小不超過(guò)200nm，呈圓球形，結(jié)構(gòu)緊密，在基因轉(zhuǎn)染中有利于細(xì)胞內(nèi)吞。
　　3.瓊脂糖凝膠電泳
　　β-CD-PAMAM和DNA在N/P比為10即達(dá)到完全結(jié)合，瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒DNA被阻滯在上樣孔內(nèi)，所以

10、在 N/P=10時(shí)，β-CD-PAMAM就可以作為基因轉(zhuǎn)染的載體。
　　結(jié)論：
　　合成的星型陽(yáng)離子聚合物β-CD-PAMAM可以用于DNA轉(zhuǎn)染，為在體外檢測(cè)其細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率、以便了解β-CD-PAMAM的基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性作用打下理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　第2章β-CD-PAMAM作為質(zhì)粒DNA傳輸載體的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　檢測(cè)納米材料β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/ pEGFP

11、-N3復(fù)合物在體外對(duì)細(xì)胞的毒性大小及其轉(zhuǎn)染效率，為進(jìn)一步體內(nèi)基因治療做準(zhǔn)備。
　　方法：
　　標(biāo)準(zhǔn)的非病毒載體聚酰胺-胺型樹狀物PAMAM[43,44,45]作為陽(yáng)性對(duì)照組，在體外培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞 Hek293細(xì)胞和神經(jīng)母瘤細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞，并制備含有EGFP基因的表達(dá)載體 pEGFP-N3，利用噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)研究納米材料β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/PEGFP-N3復(fù)合物的細(xì)胞毒性作用；然后分

12、別應(yīng)用β-CD-PAMAM和PAMAM兩種載體將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到不含血清培養(yǎng)和含血清培養(yǎng)的人胚腎細(xì)胞Hek293細(xì)胞和神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后于24h分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，激光共聚焦顯微鏡和倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞毒性試驗(yàn)：
　　在兩種細(xì)胞中，N/P<10時(shí)，所有納米材料載體和其復(fù)合物都顯示出其低毒性，細(xì)胞存活率在80％以上(P<0.05)；在 N/P>20時(shí)

13、，β-CD-PAMAM和β-CD-PAMAM/pEGFP-N3復(fù)合物的細(xì)胞存活率比PAMAM和PAMAM/pEGFP-N3復(fù)合物高(P<0.05)。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)：
　　在N/P為20、30、40結(jié)合的β-CD-PAMAM/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都比PAMAM與pEGFP-N3在 N/P=20結(jié)合的復(fù)合物高，其中，復(fù)合物在N/P=20的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最大，達(dá)到20%(P<0.05)。而在相同的N/

14、P結(jié)合的復(fù)合物轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染效率比不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基有輕度的增高。但通過(guò)T檢驗(yàn)分析，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。激光共聚焦顯微鏡和倒置熒光顯微鏡更直觀的顯示出以上的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　明確了β-CD-PAMAM的細(xì)胞毒性作用及基因轉(zhuǎn)染效率，證實(shí)β-CD-PAMAM可以作為Hek293和SH-SY5Y細(xì)胞基因傳輸?shù)妮d體，可進(jìn)一步于動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行聯(lián)合基因治療