葡聚糖-精胺陽離子聚合物基因載體體外基因轉染的研究.pdf

1、背景：基因治療是通過插入治療基因至病變細胞內而產生特定功能的蛋白質或抑制異?；虮磉_，從而治療疾病的一種新方法?；蛑委熤惺滓y題是缺乏高效、安全及靶向的基因導入系統(tǒng)，即能將治療基因輸送至特定的靶細胞內并高效表達的、無毒或低毒的基因載體。目前基因載體的主要分為兩類：病毒載體或非病毒載體。雖然非病毒載體在體內外基因轉染效率低于病毒載體，且基因表達時間短，但其具有低免疫原性、能攜帶大分子量DNA及生物安全性高等特點而倍受青睞。陽離子聚合物是

2、非病毒載體中最有潛力的一類載體系統(tǒng)，它們可通過結構修飾改變其物理化學及生物學性質。 目的：合成水溶性葡聚糖-精胺陽離子聚合物基因載體DSP，研究以DSP為粘合劑基因槍子彈的制備方法、DSP/DNA復合物和基因槍子彈的生物物理學性質、初步探討復合物的理化性質對其轉染能力的影響。 方法：研究以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應起始物，在室溫下經高碘酸鉀氧化6個小時，得到了氧化葡聚糖。通過鹽酸羥胺法測定了氧化葡聚糖醛基的含

3、量，根據(jù)此含量將一定摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應，該反應能生成含希夫氏堿的葡聚糖．精胺亞胺聚合物，所得到的亞胺聚合物在過量硼氫化鈉作用下，可還原生成穩(wěn)定葡聚糖一精胺共價陽離子聚合物(DSP)。DSP的總含氮量及伯胺的含量分別通過元素分析儀及TNBS法測定，并計算了所合成DSP的接枝度及支化度；FT-IR及<'1>H-NMR鑒定了DSP化學結構。采用激光粒度儀測定復合物溶液的粒徑和Zeta電位；瓊脂糖凝膠電泳法考察DSP與DNA的結合能力

4、，及DSP對DNA在核酸酶Ⅰ作用下的保護能力；滴定法考察DSP的在酸性條件下的緩沖能力；復合物體外轉染SMMC-7721肝癌細胞及BHK-21細胞，通過熒光倒置倒置顯微鏡觀察復合物對兩株細胞的轉染情況并計算轉染率；MTT法考察復合物細胞毒性。在此基礎上，研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈，并通過瓊脂糖凝膠電泳、核酸酶降解試驗和MTT法，分別研究了子彈的穩(wěn)定性，抗核酸酶Ⅰ能力及細胞毒性。 結果：所合成氧化葡聚糖醛基含量為8.4

5、7±0.15 mmol/g，DSP接枝度為38.9％，支化度為38.5％。DSP能通過其帶正電荷的氨基基團能與DNA帶負電荷的磷酸基團通過靜電吸附而將DNA完全壓縮并中和其負電荷，使DNA縮合形成復合物。復合物質量比(DSP/DNA)在4:1至20:1之間，能形成穩(wěn)定的復合物；復合物粒徑范圍為162.6-187.9nm，Zeta電位則從+8.45mV增至+39.6mV；DSP能充分壓縮DNA并與之緊密吸附；DSP能有效保護DNA不受核酸

6、酶Ⅰ降解，同時在一定pH范圍內載體具有較強的緩沖能力；復合物在質量比為8:1時(此時粒徑為170.8±23.9nm，Zeta電位為+18.34±1.55mV)，對SMMC-7721肝癌細胞、BHK-21細胞的轉染率均達到最高，分別為27.0±4.42％及22.2±4.63％，其效果均與Lipofectamine 2000相當；復合物的毒性隨質粒濃度及DSP/DNA質量比增加；所制備的基因槍子彈溶液在不同DSP/DNA及DNA/金比例下均