葡聚糖-精胺陽離子聚合物基因載體體外基因轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、背景：基因治療是通過插入治療基因至病變細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)或抑制異?；虮磉_(dá)，從而治療疾病的一種新方法。基因治療中首要難題是缺乏高效、安全及靶向的基因?qū)胂到y(tǒng)，即能將治療基因輸送至特定的靶細(xì)胞內(nèi)并高效表達(dá)的、無毒或低毒的基因載體。目前基因載體的主要分為兩類：病毒載體或非病毒載體。雖然非病毒載體在體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體，且基因表達(dá)時間短，但其具有低免疫原性、能攜帶大分子量DNA及生物安全性高等特點(diǎn)而倍受青睞。陽離子聚合物是

2、非病毒載體中最有潛力的一類載體系統(tǒng)，它們可通過結(jié)構(gòu)修飾改變其物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)。 目的：合成水溶性葡聚糖-精胺陽離子聚合物基因載體DSP，研究以DSP為粘合劑基因槍子彈的制備方法、DSP/DNA復(fù)合物和基因槍子彈的生物物理學(xué)性質(zhì)、初步探討復(fù)合物的理化性質(zhì)對其轉(zhuǎn)染能力的影響。 方法：研究以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應(yīng)起始物，在室溫下經(jīng)高碘酸鉀氧化6個小時，得到了氧化葡聚糖。通過鹽酸羥胺法測定了氧化葡聚糖醛基的含

3、量，根據(jù)此含量將一定摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應(yīng)，該反應(yīng)能生成含希夫氏堿的葡聚糖．精胺亞胺聚合物，所得到的亞胺聚合物在過量硼氫化鈉作用下，可還原生成穩(wěn)定葡聚糖一精胺共價陽離子聚合物(DSP)。DSP的總含氮量及伯胺的含量分別通過元素分析儀及TNBS法測定，并計(jì)算了所合成DSP的接枝度及支化度；FT-IR及<'1>H-NMR鑒定了DSP化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用激光粒度儀測定復(fù)合物溶液的粒徑和Zeta電位；瓊脂糖凝膠電泳法考察DSP與DNA的結(jié)合能力

4、，及DSP對DNA在核酸酶Ⅰ作用下的保護(hù)能力；滴定法考察DSP的在酸性條件下的緩沖能力；復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞及BHK-21細(xì)胞，通過熒光倒置倒置顯微鏡觀察復(fù)合物對兩株細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染率；MTT法考察復(fù)合物細(xì)胞毒性。在此基礎(chǔ)上，研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈，并通過瓊脂糖凝膠電泳、核酸酶降解試驗(yàn)和MTT法，分別研究了子彈的穩(wěn)定性，抗核酸酶Ⅰ能力及細(xì)胞毒性。 結(jié)果：所合成氧化葡聚糖醛基含量為8.4

5、7±0.15 mmol/g，DSP接枝度為38.9％，支化度為38.5％。DSP能通過其帶正電荷的氨基基團(tuán)能與DNA帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過靜電吸附而將DNA完全壓縮并中和其負(fù)電荷，使DNA縮合形成復(fù)合物。復(fù)合物質(zhì)量比(DSP/DNA)在4:1至20:1之間，能形成穩(wěn)定的復(fù)合物；復(fù)合物粒徑范圍為162.6-187.9nm，Zeta電位則從+8.45mV增至+39.6mV；DSP能充分壓縮DNA并與之緊密吸附；DSP能有效保護(hù)DNA不受核酸

6、酶Ⅰ降解，同時在一定pH范圍內(nèi)載體具有較強(qiáng)的緩沖能力；復(fù)合物在質(zhì)量比為8:1時(此時粒徑為170.8±23.9nm，Zeta電位為+18.34±1.55mV)，對SMMC-7721肝癌細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到最高，分別為27.0±4.42％及22.2±4.63％，其效果均與Lipofectamine 2000相當(dāng)；復(fù)合物的毒性隨質(zhì)粒濃度及DSP/DNA質(zhì)量比增加；所制備的基因槍子彈溶液在不同DSP/DNA及DNA/金比例下均