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文檔簡介
1、基因治療能夠從根本上治愈多種嚴(yán)重的疾病,包括遺傳性疾病和癌癥等。近幾十年來,非病毒基因載體因具有免疫原性低、安全性好、可包裹不同尺寸的DNA,明確的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)等優(yōu)點,受到廣泛的關(guān)注。其中,聚乙烯亞胺(PEI)、樹枝狀高分子聚氨酯(PAMAM)和聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)是研究最廣泛的非病毒基因載體。這些聚合物載體在內(nèi)涵體pH環(huán)境下具有較高的緩沖能力,可以誘導(dǎo)質(zhì)子海綿體效應(yīng)破壞內(nèi)涵體膜,促使DNA復(fù)合物從內(nèi)涵體
2、逃離從而得到高的轉(zhuǎn)染效率。文獻表明pH緩沖能力低的陽離子聚合物(如聚賴氨酸和殼聚糖等)用咪唑環(huán)基團修飾后,在內(nèi)涵體pH環(huán)境下的緩沖能力增加,轉(zhuǎn)染效率得到很大提高。以PDMAEMA為代表的陽離子乙烯類聚合物與PEI和PAMAM樹枝狀聚合物相比,具有合成簡單、可控等優(yōu)點,可方便設(shè)計得到不同結(jié)構(gòu)、組成和功能化的聚合物載體。
本研究分為三個部分:第一章簡要概述了基因傳導(dǎo)的一般過程,傳遞過程中需要克服的各種障礙,以及一些常見的非病毒
3、基因載體。第二章設(shè)計了含有咪唑環(huán)基團的乙烯類單體組胺丙烯酰胺(HA),通過自由基聚合制備了結(jié)構(gòu)和分子量可控的聚組胺丙烯酰胺(PHA),研究了其體外基因轉(zhuǎn)染活性。酸堿滴定結(jié)果表明所有的PHA聚合物在pH范圍5.1-7.2具有高的緩沖能力,是25 kDa PEI的5倍左右。12.7、17.5和28.7 kDa PHAs在N/P比大于或等于10/1的條件下,能夠有效壓縮DNA形成納米級的粒子(<220 nm),且復(fù)合物表面帶正電荷(>13 m
4、V)。值得注意的是,用pCMV-Luc和pEGFP-C1作為報告基因?qū)OS-7細(xì)胞進行體外轉(zhuǎn)染時,低分子量的PHA(例如12.7 kDa PHA)的體外轉(zhuǎn)染效率與25kDa PEI相當(dāng),而CCK-8實驗結(jié)果顯示復(fù)合物對細(xì)胞基本沒有毒性。第三章合成了分子量和結(jié)構(gòu)組成可控的側(cè)鏈含伯胺和咪唑環(huán)基團的乙烯類共聚物作為非病毒基因載體。我們采用自由基聚合技術(shù)、去Boc保護方法分別合成了基于組胺丙烯酰胺(HA)單體與丙烯酸-N-(叔丁氧羰基)氨基乙
5、酯(Boc-AEA)單體的共聚物P(HA/AEA)和組胺丙烯酰胺(HA)單體與丙烯酸-N-(叔丁氧羰基)氨基己酯(Boc-AHA)單體的共聚物P(HA/AHA)。實驗中我們通過調(diào)節(jié)加入反應(yīng)單體的比例來調(diào)節(jié)共聚物的組成,核磁計算得到共聚物中PHA單元的比例分別為70%、80%和90%左右。一方面由于咪唑環(huán)是聚合物的主要組成部分,其在內(nèi)涵體pH值條件下仍保持了高的緩沖能力;另一方面伯胺基團的存在提高了聚合物在生理pH下的電荷密度,改善了DN
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