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1、目的:利用白介素3依賴性細(xì)胞(白介素3處理6天后的老鼠骨髓細(xì)胞)建立一種體外生成鼠類破骨細(xì)胞的方法。從小鼠骨髓細(xì)胞生成破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方法包括:利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法提純出單核細(xì)胞或者利用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)處理老鼠全骨髓細(xì)胞2到3天以獲取巨噬細(xì)胞。盡管這些傳統(tǒng)的方法在體外準(zhǔn)備破骨細(xì)胞以研究破骨細(xì)胞的形成、功能、和存活方面的分子機(jī)制是足夠的,但是它們?cè)诮馕隹刂破乒羌?xì)胞前體分化和增殖的分子機(jī)制或
2、揭示早期破骨細(xì)胞的形成方面的研究上的作用不盡如人意。希望通過本研究解決傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞方法在研究上的缺陷。
方法:⑴從6到8周的C57BL/6小鼠股骨及脛骨上提取骨髓細(xì)胞,并在含有α-MEM(含10%小牛血清)培養(yǎng)基的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)過夜以除去間質(zhì)細(xì)胞。然后,收獲不貼壁的骨髓細(xì)胞繼續(xù)在含10%小牛血清的α-MEM培養(yǎng)基上培養(yǎng),一組不加白介素3(陰性對(duì)照),一組加1ng/ml的白介素3培養(yǎng)6天。6天后,陰性對(duì)照組
3、中的細(xì)胞大部分死亡,而白介素3處理過的細(xì)胞大部分仍然存活。并且,這些白介素3依賴性細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)的刺激下可以生成破骨細(xì)胞。同時(shí),這些白介素3依賴性細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的刺激下可繼續(xù)存活并增殖。4天的巨噬細(xì)胞集落刺激因子處理后的細(xì)胞可被EDTA消化,并且在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)的刺激下分化成破骨
4、細(xì)胞。⑵對(duì)由白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞生成的破骨細(xì)胞進(jìn)行體外蝕骨分析、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT)-PCR、蛋白質(zhì)印跡分析、及感染小鼠骨髓細(xì)胞研究,以檢測(cè)此方法所生成的破骨細(xì)胞與傳統(tǒng)方法生成的破骨細(xì)胞有何區(qū)別。
結(jié)果:①白介素3可以維持老鼠骨髓細(xì)胞的存活高達(dá)6天,這些存活的細(xì)胞仍然保存分化成破骨細(xì)胞的能力。白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的能力隨著白介素3處理天數(shù)的增加而減弱并且白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞在巨噬細(xì)胞
5、集落刺激因子的刺激下可進(jìn)一步擴(kuò)增的同時(shí)不影響形成破骨細(xì)胞的能力。②白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞可形成有功能的破骨細(xì)胞,這些破骨細(xì)胞還保持著骨吸收的能力。不僅如此,由白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞表達(dá)所有的破骨細(xì)胞基因。核因子κ B受體活化因子配體可激活白介素3依賴性小鼠骨髓細(xì)胞RANK基因的某些信號(hào)旁路。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)這些白介素3依賴性細(xì)胞可被編碼綠色熒光蛋白(GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
結(jié)論:⑴利用白介素3依賴
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