白介素-23誘導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)成骨分子.pdf

1、研究目的:
　　強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種主要危害男性青壯年，以炎性腰背痛為主要癥狀，導(dǎo)致骶髂關(guān)節(jié)強(qiáng)直和脊柱強(qiáng)直的疾病，其病理特征是肌腱端炎、骨侵蝕、骨贅（新骨）形成。迄今為止，AS新骨形成的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前有證據(jù)提示IL-23在AS新骨形成中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-23在肌腱端炎癥部位既能誘導(dǎo)骨形成，又能誘導(dǎo)骨破壞。IL-23可以通過(guò)RANKL等方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，但

2、對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)直接作用。正常情況下，骨代謝（骨重建）處于骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡中，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互作用、相互調(diào)節(jié)。成骨細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)M-CSF、RANKL、OPG等分子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。破骨細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)Ephrin B2、SPHK1、BMP6、Wnt10b等分子，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞前體向破骨部位趨化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟。破骨細(xì)胞也可通過(guò)增加semaphorin4D、HtrA1的表達(dá)來(lái)抑制成骨細(xì)胞分化。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)旨

3、在探究IL-23是否誘導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、HtrA1等分子，從而間接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化
　　研究方法:
　　首先，采用兩種方法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，第一種方法是用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。提取6-8周齡的C57/BL6小鼠的骨髓單核細(xì)胞，用含有M-CSF(50ng/ml)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。隨后實(shí)驗(yàn)組用含有M-CSF(50ng/ml)和RANKL(30ng/ml)的完

4、全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞5天，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。對(duì)照組用不加RANKL的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用TRAP染色來(lái)鑒定破骨細(xì)胞。第二種方法是用RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組是用含有RANKL(30ng/ml)的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞5天。對(duì)照組用不加RANKL的培養(yǎng)基培養(yǎng)。同樣采用TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞。比較這兩種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的效率，挑選一種誘導(dǎo)效率高的方法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并用real-time PCR方法檢測(cè)其TRAP、N

5、FATc1的表達(dá)情況。
　　其次，用IL-23刺激破骨細(xì)胞3h、6h、12h、24h，不加IL-23作為對(duì)照組。用real-timePCR的方法檢測(cè)Ephrin B2、SPHK1、BMP2、BMP6、Wnt10b、HtrA1等分子在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　最后，用IL-23刺激破骨細(xì)胞6h、12h、24h、48h，不加IL-23作為對(duì)照組。用western-blot的方法檢測(cè)Ephrin B2、SPHK1、BMP2、B

6、MP6、Wnt10b、HtrA1等分子在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.骨髓單核細(xì)胞經(jīng)M-CSF+RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)5日后，可見許多細(xì)胞直徑＞100um，TRAP染色為紫紅色，細(xì)胞核≥3個(gè)的多核巨細(xì)胞，即為成熟的破骨細(xì)胞。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)5日后，同樣可見一些細(xì)胞直徑＞100um，TRAP染色為紫紅色，細(xì)胞核≥3個(gè)的多核巨細(xì)胞。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)所得的破骨細(xì)胞明顯多于用RAW2

7、64.7誘導(dǎo)所得的破骨細(xì)胞。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞。用real-time PCR證實(shí)小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的TRAP、NFATc1的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。表明此方法可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，并可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞在IL-23刺激3-24h后，經(jīng)real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ephrin B2、SPHK1、BMP2在mRNA水平的表達(dá)量均增加。Ephrin B2在IL-23刺

8、激破骨細(xì)胞3小時(shí)的表達(dá)量是對(duì)照組的2.10倍。IL-23刺激3小時(shí)，SPHK1的表達(dá)量是對(duì)照組的2.30倍，IL-23刺激6h，其表達(dá)量是對(duì)照組的2.46倍。BMP2在IL-23刺激3小時(shí)的表達(dá)量較對(duì)照組升高1.46倍。采用Western blot進(jìn)一步證實(shí)IL-23可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的Ephrin B2及SPHK1的蛋白表達(dá)明顯增多。
　　3.經(jīng)real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-23刺激破骨細(xì)胞后，BMP6、Wnt10b、S