小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的體外培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、目的:
　　 體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的生成,檢測IL-1O、SOCSl、TLR4及NF-KB基因在其中的表達,探討其發(fā)揮免疫作用的機制。
　　 方法:
　　 1、分離、提純小鼠骨髓來源樹突狀細胞,分為四組進行體外培養(yǎng),分別標(biāo)記為A、B、C、D。
　　 2、培養(yǎng)過程中A、B組培養(yǎng)液中加入GM-CSF+IL-4,C、D組培養(yǎng)液中加入GM-CSF+IL-1O+TGF-β1,培養(yǎng)第3天,棄去上清,去

2、除懸浮細胞,加入新鮮培養(yǎng)液,補充細胞因子,之后隔天半量換液,至第8天,B、D組給予LPS刺激48h,促進細胞進一步分化。
　　 3、用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況,記錄生長變化。
　　 4、收集第10天的各組細胞及上清液,通過流式細胞儀,ELISA以及RT-PCR的方法對細胞進行鑒定和檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1、GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-βl、LPS等因子進行體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源細胞能

3、誘導(dǎo)出具有樹突狀結(jié)構(gòu)的細胞,且加入LPS組即B、D組樹突狀突起更加典型,B組分叉更多,突起粗壯。
　　 2、流式細胞儀檢測示B組表達更高水平的CDllc、MHC-II、CD80、CD86,分別為(94.18±1.50)％,(81.17±2.45)％,(72.85±2.24)％,(24.78±1.57)％,呈現(xiàn)成熟樹突狀細胞(mDC)的特性,而A、C、D組則低表達的上述因子,分別為未成熟樹突狀細胞(iDC)、調(diào)節(jié)性樹突狀細胞前體(

4、pDCreg)及調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(DCreg)。
　　 3、ELISA檢測各組細胞上清液中IL-12的表達水平,四組結(jié)果依次為12.28±1.67,35.30±2.36,10.32±2.23,11.17±2.82,發(fā)現(xiàn)B組表達明顯高于其他各組(P＜0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,其余三組間無明顯差異。
　　 4、實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:與iDC,mDC相比,IL-IO和SOCSI在pDCreg,DCreg中高表達(P＜