藥敏試驗(yàn)及耐藥檢測(cè)

1、,歡迎同學(xué)們學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2024/2/27,1,感染性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷--藥敏試驗(yàn)及耐藥檢測(cè),,2024/2/27,3,重點(diǎn)掌握,,1,常用的藥敏試驗(yàn)方法,※,※,,2,藥敏試驗(yàn)結(jié)果表示及其臨床意義,※,※,2024/2/27,4,,,藥敏結(jié)果的表示及其臨床意義,耐藥菌檢測(cè)試驗(yàn),抗微生物藥物敏感性試驗(yàn),耐藥機(jī)制,耐藥菌歷史,主要內(nèi)容,2024/2/27,5,Antibiotic Resistance

2、 A Global Problem,1961 — MRSA1967 — PRSP1983 — ESBLS1986 — VRE1988 — MBL1997 — VISA2002 — VRSA Emergence → Spread,2024/2/27,6,,耐藥機(jī)制,1、遺傳學(xué)機(jī)制染色體介導(dǎo)的耐藥　為細(xì)菌本身所固有的耐藥，一般具有種屬特異性，如腸球菌耐頭孢菌素，革蘭陰性桿菌耐萬(wàn)古霉素等

3、。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥　耐藥基因易于傳播，目前該類(lèi)耐藥在臨床上占有重要地位。如由質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。,2024/2/27,7,2.生物化學(xué)機(jī)制產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶使抗生素失活。如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類(lèi)鈍化酶、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶。作用靶位的改變使抗生素失去作用位點(diǎn)。如MRSA產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白2a。主動(dòng)外排機(jī)制　如銅綠假單胞菌其外膜存在著獨(dú)特的藥物泵出系統(tǒng)。細(xì)菌生物膜的形成。,耐藥機(jī)制

4、,2024/2/27,8,,2024/2/27,9,抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（antimicrobial susceptibility test AST）,簡(jiǎn)稱(chēng)藥敏試驗(yàn)，是指在體外測(cè)定抗菌藥物抑制或殺菌的能力的實(shí)驗(yàn)藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物的分組 CLSI將抗菌藥物分成A、B、C、U、O、Inv六個(gè)主要組別 A組（一級(jí)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告藥物） B組（一級(jí)試驗(yàn)，有選擇報(bào)告藥物） C組（補(bǔ)充試驗(yàn)，有選擇報(bào)告藥物） U組（僅用

5、于泌尿道的補(bǔ)充試驗(yàn)藥物） O組（有適應(yīng)癥，不允許常規(guī)試驗(yàn)并報(bào)告藥物） Inv組（處于研究階段，未被FDA認(rèn)可藥物）,,常規(guī)藥敏試驗(yàn)報(bào)告藥物為前四種,2024/2/27,10,腸球菌A組：氨芐西林、青霉素B組：達(dá)托霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/達(dá)福普汀、萬(wàn)古霉素 C組：高水平慶大霉素、鏈霉素U組：環(huán)丙、左氧、諾氟沙星、呋喃妥因、四環(huán)素,2024/2/27,11,銅綠假單胞菌A組：頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、哌

6、拉西林B組：阿米卡星、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙、左氧、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦，替卡西林 U組：洛美或氧氟沙星、諾氟沙星,2024/2/27,12,常用藥敏試驗(yàn)的方法,體外AST包括：※抑菌試驗(yàn)：紙片擴(kuò)散法 稀釋法 E-test聯(lián)合藥敏試驗(yàn)全自動(dòng)藥敏檢測(cè)系統(tǒng),2024/2/27,13,紙片擴(kuò)散法（改良Kirby-Ba

7、uer法，K-B法）,將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周?chē)鷧^(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈越大，MIC越小。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)量取的抑菌圈直徑判斷病原菌對(duì)該藥物的敏感S/中介I/耐藥R。,2024/2

8、/27,14,下一張有視頻呦！,2024/2/27,15,源 http://v.ku6.com/show/MVioGWfEmjxJOMQDpChF5w.html,,2024/2/27,16,,,,,紙片擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)易，結(jié)果直觀易于理解，但非定量結(jié)果，且對(duì)慢生長(zhǎng)菌和擴(kuò)散慢的藥物紙片法不適用。,2024/2/27,17,稀釋法 Dilution antimicrobial susceptibility test,直接測(cè)定抗菌藥物的最低抑菌

9、濃度（minimal inhibitory concentration, MIC)稀釋法包括兩種：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法?；驹恚涸谌鉁颦傊袑⒖咕幬镞M(jìn)行一系列（倍比）稀釋后，定量接種待實(shí)驗(yàn)菌，在合適的溫度下孵育一定時(shí)間，待檢菌肉眼未見(jiàn)生長(zhǎng)的最小藥物濃度，即為該藥物對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度。試驗(yàn)菌的結(jié)果報(bào)告可用MIC(μg/ml)數(shù)值或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報(bào)告。,2024/2/27,18,,儀器,手工,,,20

10、24/2/27,19,濃度梯度紙條擴(kuò)散法（E test）,是一結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)直接定量的技術(shù)。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗生素抑制細(xì)菌的特定濃度，又稱(chēng)抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關(guān)。二者直接相對(duì)應(yīng)，CLSl的 MIC折點(diǎn)值適用于E試驗(yàn)。具體操作視頻請(qǐng)點(diǎn)擊這里,2024/2/27,20,要連接網(wǎng)絡(luò)才能觀看呦,,,2024/2

11、/27,21,聯(lián)合藥敏試驗(yàn),此實(shí)驗(yàn)是為了了解兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗菌效果。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可以表現(xiàn)為無(wú)關(guān)、拮抗、相加、協(xié)同。協(xié)同作用是臨床和實(shí)驗(yàn)室期盼的結(jié)果。協(xié)同用藥最典型的例子是青霉素或其同類(lèi)物與氨基糖苷類(lèi)抗生素聯(lián)合治療腸球菌感染心內(nèi)膜炎。,2024/2/27,22,抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用目的在于： ①治療單一用藥可能不能控制的混合感染 ②治療單一抗菌藥物不能有效控制的嚴(yán)重細(xì)菌感染 ③治療病因未明的嚴(yán)重感

12、染 ④預(yù)防或推遲細(xì)菌抗生素耐藥性的發(fā)生 ⑤減少藥物的毒性反應(yīng),2024/2/27,23,耐藥菌檢測(cè)試驗(yàn),1、直接β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)?zāi)壳岸嗖捎蒙ǎ灶^孢硝噻吩為底物，直接與試驗(yàn)菌作用，紙片由黃色變?yōu)榧t色為陽(yáng)性。檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果表明：該細(xì)菌對(duì)所有對(duì)青霉素酶不穩(wěn)定的青霉素（包括青霉素和廣譜青霉素）耐藥。需要對(duì)葡萄球菌、腸球菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等常規(guī)檢測(cè)。,,,2024/2/27,24,2、超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)（e

13、xtanded spectrum beta-lactamases, ESBLs）ESBLs由革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生，質(zhì)粒編碼，其活性可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)移等方式傳遞，易于造成耐藥菌流行。檢測(cè)包括紙片法篩查和確證試驗(yàn)。產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌屬、大腸埃希菌和奇異變形桿菌應(yīng)報(bào)告對(duì)所有青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)（包括頭孢吡肟）以及氨曲南耐藥，但不包括頭霉素、碳青霉烯類(lèi)和含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑。,2024/2/2

14、7,25,,腸桿菌科細(xì)菌ESBLs的檢測(cè),2024/2/27,26,KPC酶能水解除頭霉素外的各種β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，可由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生。改良Hodge試驗(yàn),3、KPC（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）酶的檢測(cè),2024/2/27,27,4、耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin resistance staphylococci, MRS）篩選MRS多是MecA基因編碼了對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥

15、物低親和力的蛋白PBP2a，取代了固有的青霉素結(jié)合蛋白PBPs。MRS的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法是用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法，要基于頭孢西丁的結(jié)果報(bào)告苯唑西林敏感或耐藥。 MRS不論其體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果如何，其對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物和β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均無(wú)臨床療效；絕大多數(shù)的MRS具有多重耐藥性，包括氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)。臨床治療MRSA引起的感染首選萬(wàn)古霉素。,2024/2/27,28,,葡萄球菌mec-A介導(dǎo)的耐藥性檢測(cè)

16、,頭孢西丁,,2024/2/27,29,5、耐青霉素肺炎鏈球菌檢測(cè)試驗(yàn)（penicillin resistance streptococcus pneumonia, PRSP） K-B法 OX<19 mm時(shí)做青霉素MIC≧2 μg/ml,2024/2/27,30,6、高水平氨基糖苷類(lèi)耐藥的腸球菌（high-level aminoglycosde resistance, HLAR） K-B法 慶大霉素120μg，出現(xiàn)

17、中介結(jié)果（7-9 mm）需補(bǔ)做MIC進(jìn)行確證。,2024/2/27,31,7、萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus）VRE 對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥主要有5種表型VanA、VanB、VanC、VanD和VanE，除VanC為天然耐藥外，其余均為獲得性耐藥。VanA、VanB可通過(guò)質(zhì)粒將耐藥性傳遞給其他腸球菌或其他種類(lèi)的細(xì)菌，若傳遞給MRSA，則會(huì)導(dǎo)致VRSA的出現(xiàn)。VRE的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法是用紙

18、片擴(kuò)散法，對(duì)于中介的結(jié)果（15-16mm）需補(bǔ)做MIC。,2024/2/27,32,8、克林霉素誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)（D-實(shí)驗(yàn)）克林霉素能被紅霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥，靠近紅霉素紙片的克林霉素紙片抑菌圈出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，像字母D。檢測(cè)葡萄球菌,2024/2/27,33,藥敏試驗(yàn)結(jié)果的表示及其臨床意義,結(jié)果的表示方法只是對(duì)抗菌藥物臨床治療效果的一種預(yù)測(cè)。敏感(susceptible,S)：表明該菌株所致感染可使用此種抗微生物藥物常規(guī)劑量進(jìn)行治療，除

19、非存在禁忌證。耐藥(resistant,R)：耐藥是指即使使用大劑量的抗菌藥物治療時(shí)，該抗菌藥在感染部位也不能抑制該感染菌生長(zhǎng)。,※,2024/2/27,34,中介(intermediate,I)：①抗菌藥對(duì)感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中通?？蛇_(dá)到的濃度，感染菌的臨床應(yīng)答率可能低于敏感菌。②意味著某些藥物在生理濃集的部位(如尿液中的喹諾酮類(lèi)和β內(nèi)酰胺類(lèi))具有臨床效力，或者可用。③若某藥在高劑量使用時(shí)是安全的(如β內(nèi)酰胺類(lèi))

20、，則中介意味著高于通常劑量的藥物進(jìn)行治療可能有效。④中介還意味它是一個(gè)緩沖區(qū)，避免微小的、未能控制的技術(shù)因素造成重大的結(jié)果解釋錯(cuò)誤，特別是對(duì)那些藥物毒性范圍窄的藥物。,藥敏試驗(yàn)結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,35,劑量依賴(lài)敏感(susceptible-dose dependent,SDD) 是指抗菌藥對(duì)感染菌的MIC接近該藥在血液和組織中通?？蛇_(dá)到的濃度，感染菌的臨床應(yīng)答率可能低于敏感菌；當(dāng)高劑量使用該藥仍然安

21、全時(shí)，則高劑量給藥可能有效。這個(gè)概念主要用于真菌的藥敏試驗(yàn)，類(lèi)似于細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的“中介”。,藥敏試驗(yàn)結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,36,不敏感(nonsusceptible,NS) 當(dāng)某新的抗菌藥問(wèn)世時(shí)，由于尚未發(fā)現(xiàn)耐藥株，故早期的解釋標(biāo)準(zhǔn)只有敏感折點(diǎn)；當(dāng)某個(gè)分離株的MIC值高于該敏感折點(diǎn)時(shí)，就報(bào)告為不敏感。,藥敏試驗(yàn)結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,37,簡(jiǎn)而言之：S 表明推薦的抗菌藥物可以使

22、用，可能達(dá)到臨床效果；I 意味著這個(gè)范圍的抗菌藥物在常規(guī)劑量下療效不理想，高濃度下可能有效；R 意味著此種情況下抗菌藥物不能用于此菌株的治療。,藥敏試驗(yàn)結(jié)果的表示及其臨床意義,※,2024/2/27,38,SUMMIT,常用的藥敏試驗(yàn)方法：紙片擴(kuò)散法、稀釋法、E-test、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)、全自動(dòng)藥敏檢測(cè)系統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表示及其臨床意義S 表明推薦的抗菌藥物可以使用，可能達(dá)到臨床效果；I 意味著這個(gè)范圍的抗菌藥物在常規(guī)劑量下療效不

23、理想，高濃度下可能有效；R 意味著此種情況下抗菌藥物不能用于此菌株的治療。SDD 真菌的藥敏試驗(yàn)，類(lèi)似于細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的“中介”NS MIC值高于該敏感折點(diǎn)時(shí)，就報(bào)告為不敏感,2024/2/27,39,參考文獻(xiàn),藥理學(xué). 人民衛(wèi)生出版社 第2版.實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 人民衛(wèi)生出版社 第2版.實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社 第3版.臨床微生物學(xué)檢驗(yàn). 人民衛(wèi)生出版社 第5版.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程. 人民衛(wèi)生出版社 第4版.M100