流式細胞分析在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用描述

1、流式細胞分析在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用西南醫(yī)院檢驗科 黃君富,1、白血病免疫分型,FAB主要依據(jù)形態(tài)學(xué)和細胞化學(xué)進行分型。MIC方案在FAB方案基礎(chǔ)上結(jié)合了免疫學(xué)和細胞遺傳學(xué)。（M：形態(tài)學(xué) I：免疫學(xué) C：細胞遺傳學(xué)）,免疫分型與FAB的關(guān)系,FAB分型受檢查者的主觀因素影響大，符合率有一定限制。免疫標志能夠提供正常細胞在演變成惡性腫瘤過程中細胞基因及抗原標志發(fā)生變化的信息，而這種變化常常是細微的，以至于常規(guī)FAB方法不能分辨。

2、免疫分型是MIC的重要組成部分，它是對FAB分型的補充。,屬于同一種FAB型的病例，可能具有不同的免疫表型。免疫表型在AML和ALL上與FAB的不一致并不減低免疫分型在白血病患者的應(yīng)用價值，相反，免疫表型使我們對血液腫瘤細胞的生物學(xué)特征有了更深入和更精確的認識。免疫表型對腫瘤的診斷、治療策略的制定、預(yù)后判斷及腫瘤發(fā)病機制的研究都具有重要作用。,免疫分型的兩個階段,根據(jù)白血病細胞表達的系列相關(guān)抗原，確定其系列來源。如：淋系T/B、粒單

3、系、紅系、巨核系等。根據(jù)白血病細胞表達的系列分化其相關(guān)抗原進一步分型。如：早前B，前B，普通B…,急性白血病的四大免疫類型,單表型急性白血病表達某一個系列抗原為主的急性白血病雙表型/雙克隆急性白血病未分化型急性白血病,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系 列 積 分 B系 T系 粒單系 巨核系

4、紅系1.單表型 純B-ALL >2 0 0 0 0 純T-ALL 0 >2 0 0 0 純AML 0

5、 0 >2 0 0 純AML-M6 0 0 ≦2 ≦2 >2 純AML-M7 0 0 ≦2 >2 ≦2,,,,,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系 列 積 分

6、 B系 T系 粒單系 巨核系 紅系2.單表型為主 My+B-ALL >2 0 ≦2 0 0 My+T-ALL 0 >2 ≦2 0

7、 0 Ly+AML ≦2 ≦2 >2 >2 >2 T+B-ALL >2 ≦2 0 0 0 注: My+ : 髓系抗原陽性;Ly+:淋系抗原陽性,,,,,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系

8、 列 積 分 B系 T系 粒單系 巨核系 紅系3.雙表型/雙克隆型 T/B >2 >2 0 0 0 T/M 0 >2 >2 0 0

9、 B/M >2 0 >2 0 0 4.未分化型 AUL ≦2 ≦2 ≦2 ≦2 ≦2,,,,,B細胞系A(chǔ)LL的免疫分型,,,,T細胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD7 CD2 TdT FAB分型早前T-ALL

10、 + — + L1,L2 T-ALL + + + L1,L2,,,,,免疫分型的價值,確定ALL的細胞類型（B細胞或T細胞）和ALL的分化階段。鑒定AML的特征。對形態(tài)學(xué)上未分化的急性白血病有助于鑒定細胞類型。診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。,,診斷雙表型/混合細胞型急性白血病

11、。鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達（My+）或AML伴有淋系抗原表達（Ly+）。鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關(guān)的亞型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,慢性白血病免疫分型,慢性粒細胞性白血病主要用于急變期的分型（同急性白血病免疫分型）。慢性淋巴細胞性白血病除了鑒別是T還是B淋巴細胞型外，還用于與反應(yīng)性淋巴細胞增多癥的鑒

12、別，以及與部分淋巴瘤的鑒別診斷。一些少見的白血病如：毛細胞白血病、漿細胞白血病、惡性組織細胞性白血病等的診斷與鑒別診斷。,2、再生障礙性貧血的研究,AA是一組由不同發(fā)病機制介導(dǎo)的骨髓造血功能障礙綜合征，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全明了，但越來越多的臨床和實驗證據(jù)表明，免疫介導(dǎo)的造血抑制AA最常見的病理機制之一。而且，具有免疫表型異常（如：CD4/CD8倒置，CD8+、活化T細胞或TCRγδ異常增高等）的患者，臨床表現(xiàn)相對嚴重，但免疫抑

13、制治療相對有較好的療效。,常用的淋巴細胞表面標志物,淋巴細胞亞群T細胞： CD3+ 、TCRγ/δ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc)B細胞： CD19+NK細胞： CD3- CD16+ CD56+,淋巴細胞亞群細分：T細胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+

14、 Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+B細胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+,活化淋巴細胞亞群：活化總T細胞： CD3+ /HLA—DR+靜止總T細胞： CD3+ /HLA—DR-活化CD4+細胞：CD4+ /HLA—DR+活化CD8+細胞：CD8+ /HLA—DR+活化誘導(dǎo)分子： CD69白細胞介素2低親和力受體： CD2

15、5CD25+ /CD3+：活化T細胞CD25- /CD3+：靜止T細胞,根據(jù)T淋巴細胞分泌細胞因子的不同,CD4+: Th1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL4+ Th0:CD4+IFNr+IL4+ CD8+: Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD8+IFNr+

16、IL4+,Th1細胞：介導(dǎo)細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。Th1/Th2細胞平衡偏移多見于：感染癥、自身免疫病、過敏癥、排斥反應(yīng)

17、、免疫缺陷、腫瘤惡化等。檢測Th1/Th2細胞平衡主要是分析疾病發(fā)生發(fā)展的狀況，為臨床調(diào)整Th1/Th2細胞平衡偏提供正確的治療依據(jù)。,3、血栓與止血,血小板糖蛋白 血小板質(zhì)膜糖蛋白GPⅠa ：CDw49b GPⅢa： CD61GPⅠb ：CD42b GPⅣ： CD36GPⅠc ：CDw49f GPⅨ： CD42aGPⅡa ：CD29 GPⅡb： CD41GPⅡa'

18、;：CD31 血小板顆粒膜糖蛋白α顆粒：CD62P (GMP140、PADGEM)λ顆粒：溶酶體完整膜糖蛋白 CD63 溶酶體相關(guān)膜糖蛋白-1 LAMP-1 溶酶體相關(guān)膜糖蛋白-2 LAMP-2,,活化血小板檢測 CD62P， CD63 GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物(CD41/61) GPⅣ(CD36) PAC-1 Thrombospondin 血小板內(nèi)鈣離子,遺傳性血小板功能缺陷性疾病

19、診斷 巨血小板綜合癥(BSS)GP Ib-Ⅸ(CD42a/CD42b)缺陷或缺乏 血小板無力癥(CT)GP Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)缺陷或缺乏 貯存池疾病?-SPD下降,4、CD34的絕對計數(shù),隨著近年來外周血造血干細胞移植病例的日益增多，外周血造血干細胞的流式定量越來越成為一個突出的話題。如何準確地定量干細胞數(shù)量，什么是有效的質(zhì)量控制成了各大實驗室的話題。1989年，歐洲人創(chuàng)建了米蘭方案，利用SS與CD34作雙參

20、數(shù)直方圖，計算CD34陽性細胞數(shù)；同年，北歐人改進了米蘭方案，加入了對照，稱之米蘭/北歐方案。,1995年，血液病治療及移植國際聯(lián)合會(the International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE)成立了干細胞絕對計數(shù)(Enumeration)小組，致力于尋求一種簡單、快速、靈敏的流式細胞儀檢測方法去定量外周血中的造血干細胞數(shù)量。這一方法必須是對于臨床

21、實驗室中不同的流式細胞儀都有效，而且在不同的移植中心具有可比性。這一方案即在96年問世的ISHAGE方案，至今為止，其他各種方案改進均以此方案為基礎(chǔ)。,5、多藥耐藥（MDR）的研究,白血病治療的失敗再很大程度上是由于白血病細胞對化療藥物產(chǎn)生了耐藥。因此對白血病耐藥機制的研究具有重要的意義。但是耐藥的形成過程卻很多。主要有幾個方面：藥物吸收減少、細胞解毒作用增強、靶分子改變、DNA損傷修復(fù)能力增強、細胞內(nèi)藥物溢出增多、細胞凋亡的抑制等。,

22、常見的流式檢測項目：參與藥物在細胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運的蛋白： P-170、MRP、LRP、BCRP、MVP參與細胞解毒的酶： ALK、GST、GSH、MS抑制細胞凋亡的蛋白： bcl-2/bax、P53藥物泵的功能檢測： 羅丹明123（R123）或柔紅霉素,6、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH),陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)是由于造血干細胞發(fā)生體細胞突變而引起的獲得性溶血性貧血,典

23、型病例有發(fā)作夜間血紅蛋白尿,可伴全血細胞減少.其溶血是由于紅細胞膜的獲得性缺陷,對激活補體異常敏感所致的一種慢性血管內(nèi)溶血。,隨著流式細胞儀的逐漸推廣，流式細胞術(shù)檢測CD55、CD59以能從病理上提供直接的證據(jù)而得到廣泛的應(yīng)用。正常人的紅細胞、網(wǎng)織紅細胞、粒細胞、血小板上CD55、CD59表達完全陽性，而PNH患者細胞則分為三型（依據(jù)CD55、CD59缺乏或減少的程度）,流式細胞術(shù)在PNH診斷中須注意的事項：1、盡量同時檢測紅細胞和粒

24、細胞的CD55與CD59的表達情況。因為PNH克隆來源的紅細胞在溶血后和輸血后，紅細胞中PNH克隆細胞會減少或檢測不到，而對粒細胞則影響很小。同時檢測紅細胞和粒細胞CD55和CD59可以區(qū)分小細胞低色素性貧血和PNH，小細胞低色素性貧血只有紅細胞上的CD55和CD59減少，粒細胞上CD55和CD59正常。2、在檢測紅細胞的CD55與CD59時，可以用全血標記，但必須稀釋。而在檢測粒細胞的CD55與CD59的表達時，必須先溶血再標記。因

25、為紅細胞數(shù)遠遠高于粒細胞，紅細胞的存在會與粒細胞競爭對CD55與CD59的結(jié)合。,7、多發(fā)性骨髓瘤（MM）,多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞異常增生性疾病。正常漿細胞為CD38+/CD45dim/-，使用 CD38/CD45雙標記檢測外周血和骨髓標本，可以準確劃定漿細胞群。通常使用CD38和CD45，結(jié)合輕鏈檢查，對多發(fā)性骨髓瘤細胞進行分析。另外，正常漿細胞的表面標記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細胞通常為CD19-/CD56+。這樣，使

26、用流式細胞儀對外周血或骨髓標本進行多參數(shù)分析，并計算異常漿細胞含量，對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評估具有重要意義。,8、血液免疫性疾病,自身免疫性溶血性貧血特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）免疫性粒細胞減少癥 以上疾病一般檢測紅細胞、血小板、粒細胞相關(guān)的IgG,IgM,IgD,補體C3等，用以鑒別診斷和輔助臨床治療。,9、血液病的其它檢查,(1) 細胞凋亡的檢查 Fas及FasL Apo 2·7 bc