一種富含有機(jī)硒的益生菌制劑的研制與作用機(jī)理研究.pdf

1、硒是人和動(dòng)物必需的微量元素之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、提高機(jī)體免疫力和抗病力、影響人和動(dòng)物的生殖機(jī)能、抗腫瘤、抗自由基、延緩衰老和拮抗有毒元素等多種重要的生物學(xué)功能，所以日糧補(bǔ)硒現(xiàn)已是許多國家養(yǎng)殖業(yè)采取的常規(guī)措施。當(dāng)前廣泛使用的補(bǔ)硒方法是添加無機(jī)硒--亞硒酸鈉，但由于亞硒酸鈉利用率低、毒性大，其本身具有過氧化作用，而且對環(huán)境會(huì)造成潛在的污染，因此一些國家已經(jīng)限制使用亞硒酸鈉作為硒的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。有機(jī)硒與無機(jī)硒相比有許多優(yōu)勢，首先其毒性較小，適

2、口性好，便于在飼料中應(yīng)用。此外因其吸收利用率更高，可降低飼料中硒的添加量，從而減少對環(huán)境的污染。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的有機(jī)硒主要是富硒酵母，但由于富硒酵母的價(jià)格相對較高，其推廣應(yīng)用受到了一定的限制。益生菌具有維持腸道菌群平衡、防治胃腸道疾病，產(chǎn)生多種酶類、合成多種營養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等生物學(xué)功能，目前廣泛作為飼料添加劑應(yīng)用。
　　 本研究試圖通過篩選益生菌菌株，優(yōu)化培養(yǎng)條件，研制有機(jī)硒轉(zhuǎn)化促進(jìn)劑，觀察其應(yīng)用效果以及評(píng)價(jià)

3、其安全性等途徑研制一種具有有機(jī)硒和益生菌雙重作用的富硒益生菌制劑。在此基礎(chǔ)上研究富硒益生菌制劑的作用機(jī)理，為其在畜牧生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 試驗(yàn)1富硒益生菌菌株的篩選與培養(yǎng)條件的優(yōu)化本試驗(yàn)對9株益生菌進(jìn)行了篩選，然后對篩選出的益生菌的混合培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)研制了促進(jìn)益生菌將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的促進(jìn)劑。結(jié)果顯示，產(chǎn)朊假絲酵母Y2和嗜酸乳桿菌L7可作為研制富硒益生菌的菌株。富硒益生菌的培養(yǎng)條件為：特定的培養(yǎng)基，裝

4、液量100mL/500mL三角瓶，7.5 mg·L-1的Se4+濃度、在培養(yǎng)15 h時(shí)后加入Se4+，30℃培養(yǎng)36h。在該培養(yǎng)條件下，在添加有機(jī)硒轉(zhuǎn)化促進(jìn)劑的情況下，加入不同質(zhì)量的玉米淀粉進(jìn)行吸附、離心、真空抽干后獲得的三種富硒益生菌產(chǎn)物的量分別為262.97、146.48和74.43 g·L-1，硒含量分別為28.58、51.26和100.82 mg·kg-1，產(chǎn)朊假絲酵母菌數(shù)分別為4.20x108、4.60×108和1.29×10

5、8 cfu·g-1；嗜酸乳桿菌數(shù)分別為3.50x1010、2.91×1010和0.94×1010 cfu·g-1。
　　 試驗(yàn)2培養(yǎng)液中添加硒對益生菌形態(tài)與活性的影響本試驗(yàn)研究在富硒益生菌培養(yǎng)過程中添加無機(jī)硒對富硒益生菌中的產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及活性的影響。將產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌分別混合或單獨(dú)培養(yǎng)于不加硒和含硒7.5 mg·L-1的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)36 h后，分別通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察產(chǎn)朊假絲酵母

6、和嗜酸乳桿菌的形態(tài)變化；同時(shí)，將來自于不加硒和含硒培養(yǎng)液中的產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌數(shù)量分別調(diào)整為5×107cfu·mL-1和5×1.08cfu·mL-1，并重新分別接種到Y(jié)EPD或MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，36 h后分別對培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：與不加硒培養(yǎng)獲得的產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌的形態(tài)和活性相比，在含硒培養(yǎng)基中培養(yǎng)的產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌的形態(tài)和活性均未見改變。結(jié)果表明：在培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中加入適量的硒，對富硒益生菌中

7、的產(chǎn)朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌的形態(tài)和活性不產(chǎn)生影響。
　　 試驗(yàn)3富硒益生菌中硒的形式與含量測定建立了氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定富硒益生菌中總硒和有機(jī)硒的方法，研究了儀器的工作條件、試劑對硒測定的影響，探討了消化試劑對樣品消化的影響和共存離子的干擾及消除。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的工作條件下，硒的檢出限為0.0785μg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45％，線性范圍為0-100μg·L-1；應(yīng)用該方法檢測三種富硒益生菌產(chǎn)物，其總硒含量分

8、別為100.82μg·g-1、51.26μg·g-1和28.58μg·g-1，其中有機(jī)硒含量分別為93.53μg·g-1、47.19μg·g-1和26.18μg·g-1，加標(biāo)回收率在97.62％-102.80％之間.建立了氣相色譜。質(zhì)譜法測定富硒益生菌中硒蛋氨酸含量的方法，比較了3種從樣品中提取硒蛋氨酸方法的效果，確定最佳提取和測定條件為在Tris-緩沖液中酶解24 h，使用丁醇酯化，三氟醋酸酐?；难苌椒ǎ捎眠x擇離子m/z349進(jìn)

9、行測定，外標(biāo)法定量。在此條件下，硒蛋氨酸的檢出限為0.5 mg·U-1，加標(biāo)回收率在98.34％-103.84％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.96％-1.87％；測定三種富硒益生菌產(chǎn)物中硒蛋氨酸含量分別為156.40μg·g-1、74.88μg·-1和42.50μg·g-1.
　　 試驗(yàn)4富硒益生菌的安全性評(píng)價(jià)本試驗(yàn)對富硒益生菌分別進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)、蓄積毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)研究。結(jié)果顯

10、示，小鼠經(jīng)口攝入富硒益生菌，其LD50>31.25 g·kg-1；在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，富硒益生菌未表現(xiàn)出蓄積毒性，Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，作為硒的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，富硒益生菌的安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞硒酸鈉，更適于在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用。
　　 試驗(yàn)5富硒益生菌對小鼠抗氧化能力、免疫功能及腸道菌群的影響140只小鼠隨機(jī)均分為對照組、亞硒酸鈉組、富硒酵母組、富硒益生菌組和益生菌組，每天分別灌胃蒸餾水、亞硒酸鈉（2μg

11、 Se·mL-1）、富硒酵母（2μg Se·mL-1）、富硒益生菌（2μgSe·mL-1）和益生菌各0.5 mL，連續(xù)28 d。于試驗(yàn)11 d，每組隨機(jī)選擇8只小鼠腹腔注射SRBC0.2 mL進(jìn)行免疫，于試驗(yàn)15 d，測定免疫小鼠血漿IL-2和脾臟細(xì)胞空斑形成細(xì)胞溶血能力；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測定小鼠臟器指數(shù)、脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、腹腔巨噬細(xì)胞活性、全血GPX活性、血漿SOD、MDA水平、盲結(jié)腸中葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量。

12、結(jié)果顯示，胸腺指數(shù)與腹腔巨噬細(xì)胞活性，富硒益生菌組顯著或極顯著高于其他4組；脾臟指數(shù)，富硒益生菌組顯著高于對照組、亞硒酸鈉組和益生菌組；脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血漿IL-2和空斑形成細(xì)胞溶血能力，富硒益生菌組顯著或極顯著高于對照組和益生菌組；GPX與SOD活性，富硒益生菌組顯著或極顯著高于對照組和亞硒酸鈉組；MDA水平，富硒益生菌組極顯著低于對照組和亞硒酸鈉組；小鼠腸道中葡萄球菌、腸球菌和腸桿菌的數(shù)量，富硒益生菌組顯著或極顯著少于對照組、亞

13、硒酸鈉組和富硒酵母組；小鼠腸道中乳酸菌的數(shù)量，富硒益生菌組極顯著高于對照組、亞硒酸鈉組和富硒酵母組。結(jié)果表明，富硒益生菌具有提高小鼠免疫功能和抗氧化能力、調(diào)節(jié)腸道菌群的功能；其提高小鼠免疫功能的效果優(yōu)于富硒酵母、亞硒酸鈉和益生菌，提高小鼠抗氧化能力的效果優(yōu)于亞硒酸鈉，調(diào)節(jié)腸道菌群的功能優(yōu)于富硒酵母和亞硒酸鈉。
　　 試驗(yàn)6富硒益生菌對小鼠肝臟GPX-1和IDⅠ mRNA表達(dá)的影響80只小鼠隨機(jī)均分為對照組，亞硒酸鈉組，富硒酵母組

14、，富硒益生菌組，每天分別灌胃蒸餾水、亞硒酸鈉（2μg Se·mL-2）、富硒酵母（2μg Se·mL-2）、富硒益生菌（2μg Se·mL-1）和益生菌各0.5 mL，連續(xù)28 d。于實(shí)驗(yàn)28 d，每組隨機(jī)選擇10只小鼠，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測其肝臟GPX-1和IDI基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，富硒益生菌組、富硒酵母組和亞硒酸鈉組小鼠肝臟GPX-1和IDI基因mRNA表達(dá)水平均顯著或極顯著高于對照組，但富硒益生菌組、富硒酵母組和

15、亞硒酸鈉組之間沒有顯著差異。結(jié)果表明，補(bǔ)充富硒益生菌能夠提高GPX-1和IDI基因mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而提高GPX-1和IDI合成。但其提高GPX-1和IDI基因mRNA表達(dá)水平的效果與富硒酵母和亞硒酸鈉相比沒有差異。
　　 試驗(yàn)7富硒益生菌對羔羊生產(chǎn)性能、硒狀態(tài)及T3、T4含量的影響50只灘羊羔羊，隨機(jī)均分為對照組、富硒益生菌組、富硒酵母組、亞硒酸鈉組和益生菌組。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧；益生菌組日糧中添加益生菌；其余3組日糧中分別

16、添加富硒益生菌、富硒酵母和亞硒酸鈉，其劑量以硒計(jì)均為0.1 mg·kg-1飼料。整個(gè)試驗(yàn)期為56 d。在試驗(yàn)0 d和56 d分別測定生產(chǎn)性能相關(guān)指標(biāo)；在試驗(yàn)0 d、28 d和56 d分別測定全血硒含量、全血GPX濃度和血漿T3、T4水平。結(jié)果顯示，富硒益生菌組羔羊平均增重顯著高于對照組，料重比顯著低于對照組；在28 d和56 d時(shí)，富硒益生菌組羔羊全血GPX濃度和全血硒含量，均顯著或極顯著高于對照組和亞硒酸鈉組；在28 d和56 d時(shí)，

17、富硒益生菌組羔羊血漿T3水平顯著高于對照組，而血漿T4水平顯著低于對照組。結(jié)果表明，富硒益生菌能夠提高羔羊的生產(chǎn)性能、改善機(jī)體硒狀態(tài)、升高血漿T3水平、降低血漿T4水平。
　　 試驗(yàn)8富硒益生菌對羔羊組織硒含量、抗氧化能力及細(xì)胞因子水平的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)7。在試驗(yàn)56 d，分別采取肝臟、腎臟和肌肉測定其硒含量；在試驗(yàn)0 d、28 d和56 d分別測定全血GPX活性、血漿SOD活性、MDA、IL-1，IL-2和TNF-a濃度。結(jié)