異時相Cyclin B1的表達與細胞凋亡的關系及其機制的探討.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：四環(huán)素可控表達Cyclin B1的載體構建和單克隆細胞株的篩選
　　 目的：篩選四環(huán)素誘導細胞周期素B1(Cyclin B1)可控表達的293單克隆細胞株(Tetracycline-Regulated Expression 293 cells，T-Rex?-293)。
　　 方法：用多聚酶鏈反應(polymerase chain reactions，PCR)的方法從人胎肝cDN

2、A 文庫中調出帶有酶切位點的Cyclin B1基因全長，在37 ℃經(jīng)過BamH1和X-bal1雙酶切過夜后，與經(jīng)過同樣酶切后的pcDNA4/TO/myc-HisB 載體在16 度連接過夜，轉化BL21細菌感受態(tài)，然后涂在帶有氨芐抗性的LB 培養(yǎng)板上，37 度培養(yǎng)過夜，挑細菌克隆，搖菌，測序鑒定。接著大提測序正確的質粒，用脂質體Lipofectamine 2000轉染T-Rex?-293細胞，用含有殺稻瘟菌素(Blasticidin，5μ

3、g/ml)和腐草霉素(Zeocin，200μg/ml)雙藥物的DMEM 培養(yǎng)兩周后，將細胞傳96孔板，等單個細胞擴增出單細胞克隆。最后，用Western blot和流式細胞儀檢測單克隆細胞株在加入四環(huán)素誘導后目的基因的表達情況。
　　 結果：構建的pcDNA4/TO/myc-HisB-Cyclin B1 載體，經(jīng)英駿公司測序鑒定序列正確。篩選出的單克隆細胞株，在未加四環(huán)素時沒有外源性的Cyclin B1表達，在加入四環(huán)素后，3

4、小時就有表達，隨時間的增加，Cyclin B1表達量也增加，48 小時最多。
　　 結論：篩選出的T-Rex?-293單克隆細胞株能經(jīng)四環(huán)素可控表達Cyclin B1。
　　 第二部分：G0/G1期異時相Cyclin B1的表達促進細胞凋亡
　　 目的：利用四環(huán)素誘導Cyclin B1可控表達的293單克隆細胞株來證明G0/G1 期異時相Cyclin B1的表達促進細胞凋亡
　　 方法：挑選出一個最優(yōu)的T

5、hymidine的濃度，其能最大程度的阻滯細胞于G0/G1期。接著，將細胞大量阻滯在G0/G1 期，然后在阻滯好的細胞中加入微量的四環(huán)素誘導Cyclin B1表達48 小時，最后用Annexin V-PI 雙標法和API法檢測細胞凋亡的量和凋亡的周期特異性，同時用Western blot檢測細胞周期素依賴蛋白激酶1(Cdk1)的活性情況。
　　 結果：用Thymidine 處理細胞后，絕大部分細胞都同步化在G0/G1 期。在四環(huán)

6、素誘導Cyclin B1表達48 小時后，誘導組比非誘導組的Cyclin B1 蛋白總量明顯增加，細胞凋亡明顯增加。此時，活性的Cdk1 (Thr 161 磷酸化)蛋白量較未誘導組也明顯增加。
　　 結論：G0/G1 期異時相Cyclin B1的表達能促進細胞凋亡。
　　 第三部分：Cyclin B1導致的G0/G1期特異性細胞凋亡機制的探索
　　 目的：探索在由Cyclin B1 導致的G0/G1 期特異的細胞

7、凋亡中，除了激活Cdk1外，Cyclin B1 還可能和哪些蛋白相互作用，或者Cyclin B1/Cdk1 能通過磷酸化哪些蛋白質起作用。
　　 方法：我們篩選好的單克隆細胞株在加入四環(huán)素后能表達帶有Myc和His標簽的外源性Cyclin B1。將未誘導的和用四環(huán)素誘導48 小時的細胞裂解后，分別加入10μgMyc的單克隆抗體，用免疫沉淀(immune precipitation，IP)的方法將可能和Cyclin B1結合的蛋白

8、沉淀下來，接著將蛋白混合物進行SDS PAGE 電泳，用考馬斯亮藍染色法和銀染法找出未誘導組和誘導組之間的差異蛋白，然后用質譜(mass spectrometry,MASS)分析出差異蛋白的名稱。
　　 結果：用質譜鑒定出的蛋白有細胞周期素依賴蛋白激酶一(Cyclin-dependentkinase 1，Cdk1),細胞周期素依賴蛋白激酶二(Cyclin-dependent kinase 2，Cdk2)，有絲分裂阻滯缺失樣蛋白一

9、(Mitotic arrest deficient-like protein 1，MAD1-like 1，MAD1L1)和熱休克蛋白八(heat shock 70kDa protein 8 isoform 1)。
　　 結論：在由Cyclin B1 導致的G0/G1 期特異的細胞凋亡中，除了磷酸化Thr 161 殘基激活Cdk1后導致細胞凋亡外，Cyclin B1(Cyclin B1/Cdk1)與Cdk2、MAD1L1和Hsp7