Cyclin D1a-b對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、Cyclin D1作用于G1期的重要的細(xì)胞周期蛋白，可以促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞周期過程。CyclinD1的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Cyclin D1經(jīng)選擇性剪切后可得到的一種編碼特殊的異構(gòu)體cyclin D1b。細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡是相互協(xié)調(diào)，共同維持細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定，不至于細(xì)胞數(shù)量過度增減。細(xì)胞凋亡是一個(gè)多分子多基因參與的復(fù)雜過程，其中Bcl-2家族成員在凋亡調(diào)控起著重要作用，成員Bcl-2和Bcl-xL等，抑制腫瘤

2、細(xì)胞凋亡；成員Bax和Bid等，則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bcl-xL主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜之間基質(zhì)的pH值，維持跨膜電位的穩(wěn)定，保持線粒體膜的完整性；Bax與在mRNA水平表達(dá)的則可降低跨膜電位，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放。因此，兩組分子的表達(dá)水平的高低及其兩者間的比例決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的傾向性。腫瘤細(xì)胞向鄰近部位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響治療效果及判斷愈后的重要因素。腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成與其誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解

3、細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs中，MMP-2明膠酶和MMP-9明膠酶是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障。腫瘤細(xì)胞表達(dá)αvβ3與胞外基質(zhì)的相互結(jié)合后，活化的MMP-2與MMP-9的釋放顯著增強(qiáng)，影響腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移等生物行為。Sydencan-1通過分子表面的硫酸肝素側(cè)鏈可結(jié)合細(xì)胞粘附分子和基質(zhì)成分等，以共受體方式影響αvβ3的活性調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用；α5β1能夠影響的αvβ

4、3功能，sydencan-4能夠協(xié)同α5β1提高這一功效，促進(jìn)細(xì)胞間的黏附。Cdc2是αvβ3整合素的下游效應(yīng)分子。Cdc2表達(dá)上調(diào)后，主要通過與cyclin B2形成共同因子，作用下游caldesmon，影響細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)的功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。HoxD3是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，HoxD3的過度表達(dá)可以上調(diào)整合素αv、α4、aIIb和β3等的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)間的黏附。Cyclin D1b是否具有和cyclin D

5、1a促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞周期進(jìn)程一樣的作用？Cyclin D1b是否影響腫瘤細(xì)胞的預(yù)后？Cyclin D1a和cyclin D1b是否影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移？本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建重組基因質(zhì)粒cyclin D1a/b，并轉(zhuǎn)染至MCF-7人源乳腺癌細(xì)胞和BCL-7402人源肝癌細(xì)胞中，形成穩(wěn)定表達(dá)cyclin D1a/b的新細(xì)胞株。研究cyclin D1a/b對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡的作用，并觀察cyclin D1a/b在腫瘤細(xì)胞的侵襲能

6、力、穿透能力和黏附能力改變，探討其作用機(jī)制。 方法：1．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞的pcDNA3.1亞株、pcDNA3.1-cyclin D1a亞株、pcDNA3.1-cyclin D1b亞株；BCL-7402細(xì)胞的pcDNA3.1亞株、pcDNA3.1-cyclin D1a亞株、pcDNA3.1-cyclin D1b亞株，進(jìn)行MTT檢測(cè)。MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞，進(jìn)行CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，72 h流式檢測(cè)MC

7、F-7細(xì)胞和BCL-7402細(xì)胞增殖代數(shù)情況。 2．MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞接種于6孔板中，每孔中加入25 μg/ml絲裂霉素。24 h后，AnnexinV/PI標(biāo)記，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。取MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞1×106，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bid基因在mRNA水平上表達(dá)的變化情況。 3．在裸鼠的右乳墊下接種MCF-7三

8、亞株細(xì)胞，接種后第20天、第30天、第45天和第60天測(cè)腫瘤瘤體的大??；接種后第30天和第60天處理裸鼠，稱取瘤重。裸鼠肝內(nèi)接種BCL-7402三亞株細(xì)胞，接種后第30天和第60天處理裸鼠，稱取瘤重。 4．收集MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，平皿劃痕，24 h后，鏡下觀察腫瘤細(xì)胞向劃痕處侵襲生長(zhǎng)的情況。MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞分別加入Transwell上室，48 h后，計(jì)數(shù)

9、遷移至下室中的細(xì)胞數(shù)。MCF-7三亞株細(xì)胞和BCL-7402三亞株細(xì)胞培養(yǎng)2 h后，LDH檢測(cè)黏附至經(jīng)FN包被過的96孔板上的細(xì)胞量。 5. 在裸鼠的右乳墊下分別接種MCF-7三亞株細(xì)胞和裸鼠肝內(nèi)接種BCL-7402三亞株細(xì)胞，接種后第30天和第60天處理裸鼠，取肺臟、肝臟、血液、淋巴、腎臟、胃臟、皮膚和骨髓等組織進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)在裸鼠組織中cyclin D1a/b mRNA的表達(dá)情況。同時(shí)，組織取樣進(jìn)行HE染色和免疫組化檢

10、測(cè)。 6．ECM刺激24 h后的腫瘤細(xì)胞和未經(jīng)ECM刺激的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行明膠酶活性的檢測(cè)。Real-time PCR檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中αv、β3、syndecan-1和syndecan-4 mRNA的表達(dá)情況；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)αvβ3腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)情況，western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)syndecan-1和syndecan-4蛋白表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)ECM刺激24 h和ECM未刺激的腫瘤細(xì)胞內(nèi)cdc2 m

11、RNA表達(dá)情況和western blot檢測(cè)cdc2蛋白表達(dá)情況。免疫共沉淀方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞HoxD3結(jié)合cyclin D1的情況。 結(jié)果：1．MTT檢測(cè)結(jié)果表示，在MCF-7細(xì)胞和BCL-7402細(xì)胞中，cyclin D1a組與pcDNA3.1組和cyclin D1b組比較，能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。CSFE標(biāo)記結(jié)果表示，在MCF-7細(xì)胞和BCL-7402細(xì)胞中，cyclin D1a組與pcDNA3.1組和cyclin D1b組比較

12、，能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖；cyclin D1b能促使特定的一小群細(xì)胞以更快的速度增殖。 2. MCF-7細(xì)胞，cyclin D1a組、pcDNA3.1組和cyclin D1b組腫瘤細(xì)胞的凋亡率分別為：19.92％，17.18％，15.84％；三組間細(xì)胞的凋亡沒有明顯的差別。BCL-7402細(xì)胞，cyclin D1a組、pcDNA3.1組和cyclin D1b組腫瘤細(xì)胞的凋亡率分別則是：34.77％，29.55％，22.52％，cyc

13、lin D1b組與pcDNA3.1組相差12.25％。在絲裂霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞作用24 h后，BCL-7402細(xì)胞中的cyclin D1b組，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)增加；MCF-7細(xì)胞中，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)在三組間沒有變化；抗凋亡基因Bcl-xL，促凋亡基因Bax和Bid mRNA的表達(dá)在絲裂霉素作用前后，并沒有明顯的改變。在BCL-7402細(xì)胞中，抗凋亡基因Bcl-2 參與cyclin D1b促進(jìn)細(xì)胞抵抗絲

14、裂霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 3．在第30天和第60天，右乳墊下接種MCF-7細(xì)胞的裸鼠和肝內(nèi)接種BCL-7402細(xì)胞裸鼠的瘤重，cyclin D1a組保持較快的增長(zhǎng)速度，與pcDNA3.1組、cyclin D1b組比較有顯著性差異，cyclin D1b組瘤重與pcDNA3.1組重，但兩者差異不明顯。 4．腫瘤細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，cyclin D1b組腫瘤細(xì)胞的黏附能力強(qiáng)；腫瘤細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表示，cyclin D1b組腫瘤

15、細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)；Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了cyclin D1b組腫瘤細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)的結(jié)果。 5．在裸鼠體內(nèi)接種MCF-7細(xì)胞和BCL-7402細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，第30天和第60天在cyclin D1b組裸鼠在肺臟和淋巴組織RT-PCR檢測(cè)到cyclin D1b的表達(dá)，第60天HE染色和免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，cyclin D1b組在裸鼠肺臟組織有微小轉(zhuǎn)移灶的形成。第90天，cyclin D1b組在裸鼠肺臟組織有肉眼可見轉(zhuǎn)

16、移灶的形成。 6．明膠酶活性的檢測(cè)結(jié)果表示，ECM 未刺激后24 h MCF-7 三亞株細(xì)胞和BCL-7402 三亞株細(xì)胞proMMP-2/9和active MMP-2/9 酶活性沒有明顯的差異。 結(jié)論：在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中，cyclin D1a作用于G1期重要的細(xì)胞周期蛋白，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞周期過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；cyclin D1b參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡產(chǎn)生。HoxD3