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文檔簡介
1、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)是17β-雌二醇在體內(nèi)的生理代謝產(chǎn)物,它具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長和抗血管生成的活性,但作用機(jī)制尚不明確。本文以食管癌EC9706細(xì)胞系為對象,研究2-ME對EC9706細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡效果,并初步考察其作用機(jī)制。
1.2-ME對EC9706細(xì)胞增殖及凋亡的影響
EC9706細(xì)胞系分別經(jīng)0.1,0.5,1,2,5,10μmol/L,2-M
2、E處理24,48和72h后進(jìn)行生長抑制分析。MTT法檢測其對EC9706細(xì)胞的生長抑制效果,結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活百分比表示。數(shù)據(jù)顯示,1-10μmol/L2-ME可不同程度抑制EC9706細(xì)胞生長,并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間和劑量依賴性,其中5μmol/L和10μmol/L2-ME處理72h后細(xì)胞存活率分別為50.03%和40.33%,2-ME分別處理48h和72h后對EC9706細(xì)胞系的IC50分別為5.37μmol/L和4.14μmol/L
3、。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)2-ME作用后細(xì)胞出現(xiàn)變圓,皺縮,細(xì)胞間隙增大等預(yù)示其凋亡的形態(tài)變化。流式細(xì)胞術(shù)PI單染法分析細(xì)胞周期變化顯示,2-ME可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,用10μmol/L藥物處理24h后細(xì)胞G2/M期比例達(dá)到98.70%,且S期和G1期比例明顯減少。Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞早期凋亡,結(jié)果顯示:在相同時(shí)間內(nèi)隨著藥物濃度的升高,細(xì)胞早期和晚期凋亡比例也分別增加,經(jīng)5μmol/L和10μmo
4、l/L2-ME處理24h細(xì)胞早期和晚期凋亡比例分別為2.26%和6.41%,9.41%和19.74%,表明2-ME可抑制EC9706細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)其凋亡,并可誘導(dǎo)該細(xì)胞系產(chǎn)生G2/M期阻滯。
2.2-ME對cyclin B1,c-Myc等腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響
該部分采用Trizol法提取2-ME處理前后EC9706細(xì)胞總RNA,RT-PCR法檢測細(xì)胞中Bcl-2,Bax,cyclin B1,Tp53和
5、c-Myc五種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示10μmol/L2-ME作用24h可使cyclin B1基因mRNA表達(dá)水平上調(diào),而進(jìn)一步延長作用時(shí)間對cyclin B1 mRNA表達(dá)無明顯影響;隨著藥物作用時(shí)間的延長,c-Myc mRNA表達(dá)水平逐漸上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2-ME可影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因cyclin B1和c-Myc的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。2-ME可能通過上調(diào)cyclinB1 mRNA的表達(dá),參與細(xì)胞周期G2/M期阻滯及抑制細(xì)
6、胞增殖;c-MycmRNA表達(dá)上調(diào)可能參與了2-ME誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞系凋亡的過程。
3.2-ME對c-Myc、eyclinB1蛋白表達(dá)的影響
實(shí)驗(yàn)采用Western Blot分析了2-ME作用后兩蛋白表達(dá)情況,以檢測c-Myc和cyclin B1轉(zhuǎn)錄表達(dá)改變是否可最終導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平的改變。1-10μmol/L的2-ME作用24h可上調(diào)cyclin B1蛋白表達(dá),采用1μmol/L2-ME分別處理EC9
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