鞘磷脂合酶異常表達與細胞凋亡關系的探討.pdf

1、鞘磷脂合酶是催化鞘磷脂生物合成的最后一步的關鍵酶,它以神經(jīng)酰胺和卵磷脂為底物,催化形成鞘磷脂和甘油二酯。鞘磷脂合酶在人體有兩種異構體,分別稱為SMS1和SMS2,SMS1主要存在于高爾基體,SMS2主要存在于細胞膜。為判斷SMS與細胞凋亡的關系,我們用pcDNA-SMS1和pcDNA-SMS2轉染CHO細胞,構建成分別穩(wěn)定高表達SMS1和SMS2的細胞模型(CHO-SMS1和CHO-SMS2)。Lysenin細胞毒實驗和DilC16標記

2、細胞膜實驗表明,與野生型CHO細胞相比,CHO-SMS1和CHO-SMS2細胞膜有更高的鞘磷脂含量,也具有更多的去垢劑不溶性膜成分。流式細胞檢測,細胞caspase-3mRNA水平及蛋白水平檢測結果表明,TNFα刺激后的CHO-SMS1和CHO-SMS2細胞出現(xiàn)比野生型細胞更高的細胞凋亡。檢測細胞內(nèi)相關脂類含量表明,CHO-SMS1和CHO-SMS2細胞內(nèi)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、甘油二酯的含量以及神經(jīng)酰胺:鞘磷脂比率均顯著性升高,而卵磷脂含量

3、無明顯改變。我們繼續(xù)用siRNA干擾THP-1來源的巨噬細胞(TDMC),SMS1或SMS2siRNA干擾可顯著性降低TDMC細胞的SMS酶比活性,并抑制LPS誘導的TDMC細胞凋亡。脂類測定表明,TDMC分別經(jīng)各種siRNA處理和LPS刺激后,與對照組細胞相比,SMS1siRNA或SMS2siRNA干擾的TDMC細胞內(nèi)SM和DAG都顯著性下降,而卵磷脂和神經(jīng)酰胺的含量以及神經(jīng)酰胺:鞘磷脂比率均無顯著性改變。Lysenin細胞毒實驗表明

4、,SMS干擾后的TDMC細胞膜鞘磷脂含量下降。而用免疫熒光流式細胞技術測定表明,SMS的干擾抑制了LPS刺激后TDMC細胞膜TLR4/MD2復合體的形成。我們的實驗表明,在CHO細胞中,SMS的高表達,可能通過神經(jīng)酰胺的含量增高促進TNFα誘導的細胞凋亡,但不排除DAG升高激活新型PKC介導信號傳導的可能。而在TDMC細胞中,SMS的敲減可能影響脂筏的功能、減少TLR4/MD2受體復合體的形成抑制了LPS誘導的細胞凋亡,也可能通過DAG