棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體基因組細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建及其鑒定.pdf

1、棉花是我國主要的經(jīng)濟作物之一，隨著我國紡織工業(yè)和人民生活水平的提高，中國已經(jīng)成為世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，對棉花的需求量在不斷增加，為了滿足人們的需求，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的棉花新品種是解決問題的必然途徑。利用棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)系培育棉花雜交品種成為當(dāng)今世界棉花育種的主要研究方向。大量的研究表明，細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體DNA的變異有密切的聯(lián)系。因此，為了更好的研究細(xì)胞質(zhì)雄性

2、不育與線粒體DNA之間的關(guān)系，本研究將構(gòu)建棉花的線粒體基因組細(xì)菌人工染色體文庫，并對文庫進行了初步的評價，為更深入的了解和解釋細(xì)胞質(zhì)雄性不育與線粒體之間的關(guān)系打下扎實的基礎(chǔ)。 本研究以陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A的黃化苗為材料，參考水稻、玉米等主要農(nóng)作物線粒體基因組細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建方法，并結(jié)合棉花本身含有棉酚、單寧等易氧化物質(zhì)的特殊性，建立了一套構(gòu)建高質(zhì)量線粒體基因組BAC文庫的體系。該體系包含三個至關(guān)重要的條件：高分

3、子質(zhì)量的mtDNA的提取、脫磷效果較好的載體的制備、轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞的制備。 在分離制備線粒體及其DNA的過程中，利用蔗糖不連續(xù)密度梯度超速離心獲得的線粒體經(jīng)熒光鏡檢測表明其完整性好、無葉綠體和細(xì)胞核等污染，利用包埋裂解獲得的線粒體DNA經(jīng)過溶膠酶切、PCR擴增等檢測反應(yīng)表明所提取的線粒體DNA的純度較高、質(zhì)量較好；對制備的載體經(jīng)過自連反應(yīng)檢測，脫磷效果較好，自連效率低；對制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率進行檢測，表明其已達到1

4、.22×10<'10>cfu/μ g，即大于10<'10>cfu/μg。進一步表明，上述的三個條件完全符合構(gòu)建棉花線粒體基因組細(xì)菌人工染色體文庫的要求。 本研究利用所建立的BAC文庫構(gòu)建技術(shù)體系，成功的構(gòu)建了陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A線粒體基因組細(xì)菌人工染色體文庫。該文庫以單克隆形式保存，包含約3840個克隆子，平均插入片段約15.5kb，重組率大于93﹪，空載率小于6.23﹪，克隆子的穩(wěn)定性好，覆蓋率超過80倍。此外，利用