多枝賴草基因組可轉(zhuǎn)化人工染色體（TAC）文庫的構(gòu)建、鑒定和篩選.pdf

1、多枝賴草(Leymus multicaulis)(2n=4x=28=14Ⅱ，XmNs)是禾本科小麥族大麥亞族賴草屬小粒種子類型的一個種，是我國新疆重要天然牧草，它分布于鹽漬化荒漠草甸，目前已被證實具有突出的耐干旱、耐鹽堿、耐黃矮病、耐蚜蟲、耐瘠薄、耐污染等優(yōu)異抗逆特性。這些特性都是目前種植的大多數(shù)農(nóng)作物、牧草與草坪草栽培品種，本身缺乏急需改良的特性。由于主要在我國分布，國外對其利用的研究較少。因此，分離克隆控制這些優(yōu)異抗逆特性的功能基因

2、是非常必要的。 植物可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)載體結(jié)合了PAC載體和雙元載體的優(yōu)點，含P1質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒的復(fù)制子，能在大腸桿菌(Escherichia coli)和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中以單拷貝形式復(fù)制，一旦篩選到目標(biāo)陽性克隆，不需要做繁瑣并有可能導(dǎo)致目標(biāo)基因丟失的亞克隆工作，不需要重新構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，町直接利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)到植物體中進(jìn)行基因功能互補(bǔ)實驗，從而加速目的基因的實用化

3、進(jìn)程。 為了克隆和轉(zhuǎn)化多枝賴草的優(yōu)異抗逆性基因，以多枝賴草葉為材料提取細(xì)胞核，經(jīng)鋼絲細(xì)胞篩過濾，多次回收濾渣和離心上清中的細(xì)胞核，相差顯微鏡調(diào)濃度達(dá)10<'8>個/mL后，經(jīng)LMP包埋，蛋白酶K降解核蛋白，脈沖電泳純化回收后，在LMP凝膠中純化2Mb以上DNA，經(jīng)HindⅢ部分酶切再用脈沖電泳回收不同大小范圍的DNA，電洗脫濃縮除鹽，與TAC載體連接后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入細(xì)菌DH10B，在卡那霉素和蔗糖選擇壓下篩選陽性克隆。用兩種TAC載

4、體pYLTAC17和pYLTAC747H分別構(gòu)建了文庫Ⅰ和Ⅱ，約16.5和123.6萬個克隆，插入片段長度為9kb～300kb，估計覆蓋3～5倍多枝賴草基因組大小。文庫以混合克隆形式保存在12×2塊深孔96孔板中，每孔1.2 mL菌液中平均約含500個克??；同時從文庫Ⅰ和Ⅱ分別挑取2501和2890個單克隆存于14塊384孔板中。 為了后續(xù)文庫鑒定，將12塊深孔96孔板中的40多萬個混合克隆轉(zhuǎn)存到3塊384孔板中，連同14塊單克

5、隆384孔板都用GeneTAC<'TM> G3復(fù)制了2份，點高密度雜交膜6張。以多枝賴草谷胱甘肽還原酶基因5`RACE-GR和3`、RACE-GR為探針初步篩選到19個陽性克??；同時還以6個多枝賴草抗逆相關(guān)EST序列，在GenBank、EMBL和DDBJ三大核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對延伸，均得到了相應(yīng)電子克隆序列，各設(shè)計3對引物，準(zhǔn)備用PCR-Pool法對文庫Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行全面的篩選。為多枝賴草抗性基因的克隆、物理圖譜的構(gòu)建、功能驗證等基因組有關(guān)