幾類小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系線粒體DNA的分子標(biāo)記及變異性研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是一種母性遺傳性狀，是作物雜種優(yōu)勢利用的重要基礎(chǔ)。小麥?zhǔn)鞘澜缭耘嗝娣e最廣的作物，對其雄性不育機(jī)理的揭示，特別是雜種優(yōu)勢的利用一直是本領(lǐng)域設(shè)法攻克的科學(xué)難關(guān)。然而，其雄性不育機(jī)理研究所積累的資料十分有限。因此，有必要將更多的關(guān)注投入到小麥雄性不育機(jī)理的研究方面，這對于加強(qiáng)小麥雜種優(yōu)勢研究與利用具有重要的理論和實(shí)踐意義。對其它物種CMS的廣泛研究表明，由于線粒體DNA(mtDNA)的變異所引起線粒體功能的異常，進(jìn)而可

2、導(dǎo)致花粉在發(fā)育中敗育而產(chǎn)生雄性不育。 本研究以小麥近緣屬的四種山羊草、對應(yīng)山羊草細(xì)胞質(zhì)的小麥異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以及不育系與恢復(fù)系所組配的雜種F<,1>為試材，在同一細(xì)胞質(zhì)起源背景下利用RAPD標(biāo)記對山羊草、不育系及其雜種F<,1>的mtDNA的變異性進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，獲得如下重要結(jié)果： (1)山羊草與相對應(yīng)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在mtDNA上存在明顯差異。其中，引物OPY-01的RAPD擴(kuò)增圖譜在粘果山羊草Ae．kots

3、chyi和不育系ms(Ae．kotschyi)-90-110間存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物$32的RAPD擴(kuò)增圖譜在易變山羊草Ae．variabilis和不育系ms(Ae．variabilis)-90-110間存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物$22的RAPD擴(kuò)增圖譜在偏凸山羊草Ae．ventricosa和不育系ms(Ae．ventricosa)-90-110間存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物$202、OPB-05、OPA-04、S153、S21

4、均在二角山羊草Ae．bicornis和不育系ms(Ae．bicornis)-90-110的mtDNA中擴(kuò)增出穩(wěn)定和可重復(fù)的差異。表明在異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育過程中線粒體基因組受到質(zhì)核互作的影響而發(fā)生變化；不育系與對應(yīng)細(xì)胞質(zhì)的山羊草相比，其mtDNA存在明顯的變異性；而且不同類型的不育系mtDNA變異性不同，因此其對應(yīng)的不育性也不同。這種變異性很可能會(huì)引起線粒體基因結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙。因此，以上標(biāo)記可作為鑒別雄性不育相

5、關(guān)基因的分子標(biāo)記。 (2)不育系與相應(yīng)的可育雜種Fl在mtDNA上存在明顯差異。其中，引物OPY-01對不育系ms(Ae．kotschyi)-90-110和雜種Fl代ms(Ae．kotschyi)-90-110×5253的mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物OPD-05對不育系ms(Ae．variabilis)-90-110和雜種F<,1>代ms(Ae．variabilis)-90-110×5253的mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

6、存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物S21對不育系ms(Ae．ventricosa)-90-110和雜種F<,1>代ms(Ae．ventricosa)-90-110x5253的mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異；引物OPP-02對不育系ms(Ae．bicornis)-90-1lO和雜種F<,1>代ms(Ae．bicornis)-90-110x5253的mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物存在穩(wěn)定和可重復(fù)的差異。結(jié)果表明，核育性恢復(fù)基因?qū)Σ挥颠M(jìn)行育性恢復(fù)的

7、過程，線粒體DNA再次發(fā)生變異；對于不同不育類型其線粒體DNA的變異性不同，因此各不育系的恢復(fù)性也不同。這亦表明，線粒體基因組的變異不是隨機(jī)的，而是在受核基因組主導(dǎo)下發(fā)生各種變化，不同核背景對線粒體基因組產(chǎn)生的效應(yīng)不同。核育性恢復(fù)基因的導(dǎo)入導(dǎo)致雜種F<,1>代的mtDNA所發(fā)生的變異可能涉及到雄性不育相關(guān)基因區(qū)域，因此，不育系和對應(yīng)的雜種F<,1>的特異擴(kuò)增片段可作為鑒別雄性不育相關(guān)基因的分子標(biāo)記。 (3)以小麥黃化苗為材料建立了一種小

8、麥mtDNA的高效提取方法。通過簡單差速離心、DNase I處理得到無核DNA雜質(zhì)的線粒體，用SDS和蛋白酶K裂解線粒體，經(jīng)酚/氯仿抽提除去蛋白，并用RNase A消化而得到單純mtDNA。對所提取的mtDNA進(jìn)行紫外吸收光度分析，A<,260>/A<,280>平均為1.92，A<,260>/A<,230>平均為2.09，平均每克黃化苗可提取mtDNA26.85 ug；并對mtDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和RAPD擴(kuò)增，均得到清晰的電泳圖譜