重組PRRSVORF5基因減毒豬霍亂沙門氏菌C78-1生物學(xué)及免疫學(xué)特性初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)引起的以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀及高死亡率為特征的傳染病，并已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。沙門氏菌作為一種細(xì)胞內(nèi)侵襲性寄生菌，能有效的呈遞外源抗原，能同時(shí)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗沙門氏菌和誘導(dǎo)外源蛋白的細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。本研究以攜帶 PRRSV ORF5基因的重組減毒豬霍亂沙門氏菌為研究對(duì)象，檢測(cè)了其生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性，為P

2、RRS新型基因工程疫苗的研究和減毒豬霍亂沙門氏菌攜帶和表達(dá)外源基因的可行性提供了新的思路。
　　（1）實(shí)現(xiàn)了PRRSV ORF5的原核表達(dá)將PRRSV ORF5基因的N端的31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽編碼序列截去，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-dORF5并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)表明，表達(dá)的PRRSV GP5重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。進(jìn)而將表達(dá)的 GP5蛋白經(jīng)鎳柱純化并復(fù)性后，得到了純化和復(fù)性的

3、 GP5蛋白，為進(jìn)一步研究 GP5蛋白的生物學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　?。?）重組PRRSV ORF5減毒豬霍亂沙門氏菌的生物學(xué)特性研究對(duì)重組菌的表型性狀、生長(zhǎng)特性、穩(wěn)定性以及安全性等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其表達(dá)的GP5蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果顯示，該重組菌株恢復(fù)了在 DAP陰性環(huán)境中生存的能力；同時(shí)不能利用麥芽糖、果糖及蔗糖等碳源，但仍能夠利用葡萄糖，其生長(zhǎng)速度明顯低于強(qiáng)毒株 C78-1，

4、而與?crp?asdC78-1相比沒有明顯變化；在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)能夠穩(wěn)定遺傳578 bp dORF5基因片段。Western-blot分析證實(shí)重組菌表達(dá)的 GP5蛋白能與 PRRSV陽性血清特異性結(jié)合；通過口服感染的途徑，測(cè)得親本株 C78-1的毒力是重組菌?crp?asdC78-1(pYA-dORF5)的492倍，而疫苗株C500的毒力是重組菌的1.31倍。
　?。?）重組PRRSV ORF5減毒豬霍亂沙門氏菌免疫學(xué)特性初步研

5、究將重組菌接種小鼠，對(duì)其在小鼠體內(nèi)的分布情況進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，分別應(yīng)用 ELISA方法檢測(cè)小鼠不同時(shí)期血清中抗PRRS GP5抗體、沙門氏菌抗體和腸液中SIgA抗體的產(chǎn)生情況以及 MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞分化情況，以了解重組菌的免疫學(xué)特性。結(jié)果顯示，重組菌能夠在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定存活，具有良好的侵襲力。血清抗體IgG檢測(cè)結(jié)果顯示，在二次免疫后第1周，抗 GP5抗體達(dá)到高峰，OD值達(dá)到0.788，此時(shí)空白菌對(duì)照組和 PBS對(duì)照組的 OD值僅為0.0