微囊化攜PEDV基因的減毒沙門氏菌疫苗的仔豬免疫研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是引起仔豬早期死亡的重要病毒性腸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。局部腸粘膜分泌型IgA(sIgA)在抗PEDV感染中發(fā)揮著重要作用，目前采用的常規(guī)疫苗不能刺激機體產(chǎn)生足夠的sIgA，因而預(yù)防該病效果并不理想，無法有效地控制該病的區(qū)域性流行。因此研發(fā)一種可以誘導(dǎo)較強的粘膜免疫，同時刺激機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的新型疫苗，對于控制我國PED疫情具有重要的意義。

2、
　　本研究以構(gòu)建好的重組減毒沙門氏菌(S.C500/pVAX1-SAB、S.C500/pIRES-M-N)為材料，海藻酸鈉為囊材，采用乳化法制備出重組減毒沙門氏菌微膠囊，并進行了工藝的優(yōu)化和性能的研究，然后將微囊疫苗口服免疫仔豬評價其免疫效果，主要研究內(nèi)容如下:
　　1、重組減毒沙門氏菌微囊的制備
　　以單因素實驗為基礎(chǔ)，選擇合適的因素和水平設(shè)計正交實驗以優(yōu)化微囊的制備工藝，得到最適制備工藝條件:海藻酸鈉濃度為1.5

3、％，菌膠體積比1∶6，乳化劑含量0.4％，氯化鈣濃度0.1％，攪拌速度600rpm，乳化時間10min，該條件下制備的微膠囊包埋率34.1％，含菌量為4.31×109CFU/g。
　　2、重組減毒沙門氏菌微囊的性能研究
　　將制備的微囊置于人工胃酸，人工膽汁、人工腸液以及在人工模擬消化道中，考察菌體的耐酸，耐膽汁和釋放菌體性能。結(jié)果顯示:微膠囊在人工胃液中處理4h后，存活率為73.21％;在人工膽鹽溶液中處理4h后，存活率為

4、74.07％，顯著大于未微囊化重組減毒沙門氏菌的存活率;微囊制劑在人工腸液中處理120min后發(fā)生崩解，能夠快速地釋放菌體，具有良好的腸溶性。微囊化重組菌體經(jīng)過人工模擬消化道環(huán)境處理后存活率為55.17％，未微囊化重組菌存活率僅為5.42％，可見將重組菌微囊化后可以減少胃液，膽汁對菌體的殺傷作用，順利地到達腸道。
　　3、重組減毒沙門氏菌微囊口服免疫仔豬的研究
　　將微囊化重組菌、未微囊化的重組菌、微囊化空載體菌、空載體菌以

5、8.62×109CFU/頭的劑量和PEDV滅活苗以1.5mL/頭分別免疫仔豬，對各免疫組仔豬進行血清和糞便采集，檢測免疫仔豬外周血T淋巴細(xì)胞增殖情況，用ELISA試劑盒檢測仔豬不同免疫時間段血清中PEDV抗體、沙門氏菌抗體、IL-
　　4、IFN-γ細(xì)胞因子水平，以及仔豬糞便中IgA動態(tài)變化。檢測外周血淋巴細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示:在免疫第42d后，微囊化重組沙門氏菌組與未微囊化重組菌、微囊化空載體菌、空載體菌和疫苗組差異不顯著(P＞0

6、.05)。檢測血清中PEDV抗體結(jié)果顯示:整個免疫期間滅活疫苗組PEDV抗體水平顯著高于微囊化重組菌組(P＜0.05)，在免疫第42d后，微囊化重組菌組PEDV抗體水平顯著高于未微囊化重組菌、微囊化空載體菌、空載體菌和對照組(P＜0.05)。檢測免疫仔豬血清中沙門氏菌抗體結(jié)果顯示:在免疫第42d后，微囊化重組菌組沙門氏菌抗體水平顯著高于疫苗組、未微囊化重組菌組、空載體菌組和對照組(p＜0.05)。檢測免疫仔豬糞便中IgA抗體結(jié)果顯示:免

7、疫第42d后，微囊化重組菌組IgA抗體水平顯著地持續(xù)高于滅活疫苗組、空載體組、微囊化空載體組和對照組(P＜0.05)。檢測血清中的IL-4和IFN-γ結(jié)果顯示:免疫第42d后，微囊化重組菌組血清中IL-4含量均上升且顯著高于未微囊化重組菌、空載體菌和對照組(P＜0.05)，與疫苗組和微囊化空載體菌組相比無顯著差異(P＞0.05);微囊化重組菌組血清中IFN-γ含量顯著高于對照組(P＜0.05)，與未微囊化重組菌、微囊化空載體菌、空載體菌