腸炎沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因鑒定、缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、禽沙門氏菌病是指沙門氏菌屬細(xì)菌引起的禽類急性或慢性疾病的總稱，臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎。我國的禽沙門氏病比較復(fù)雜，雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒三種疾病并存，它不僅是養(yǎng)禽業(yè)各個(gè)時(shí)期的經(jīng)濟(jì)問題，而且也是家禽及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的障礙。沙門氏菌可形成生物被膜，而細(xì)菌處于生物被膜狀態(tài)可增強(qiáng)細(xì)菌對不利條件如干燥、極端的溫度、抗菌素和消毒劑的抵抗力。這不僅使得沙門氏菌在家禽飼養(yǎng)環(huán)境和體內(nèi)長期存活而不易被消滅，導(dǎo)致家禽的感染和蛋、肉的污染，而且以生物被膜

2、形式存在的細(xì)菌在肉食品加工過程中不能被正常的清洗程序所去除，這也是造成人的食源性沙門氏菌病發(fā)生的重要原因。本研究主要通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法鑒定獲得腸炎沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因，以自殺性載體構(gòu)建插入缺失突變株，初步探索了生物被膜與致病性的關(guān)系，為闡明生物被膜在腸炎沙門氏菌中的致病作用以及研制減毒沙門氏菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入鑒定腸炎沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因
　　 利用結(jié)晶紫染色定量法對74株雞源的

3、腸炎、雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌進(jìn)行生物被膜測定，結(jié)果表明所試84％的雞源沙門氏菌菌株可形成生物被膜。選擇生物被膜生長形成能力強(qiáng)的腸炎沙門氏菌CMCC50041，采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入法構(gòu)建突變株庫，共獲得1924個(gè)突變株;篩選獲得的生物被膜形成能力降低的突變株經(jīng)生長曲線測定、測序和序列比對及southernblot分析鑒定出15個(gè)插入基因，它們分別為metE、ompR、rpoS、rfaG、rfaJ、rfar、rfaP、rfbH、rhl

4、E、spiA、steB、tpx、ybdN和2個(gè)未知功能的基因。其中，12個(gè)基因是影響生物被膜形成新鑒定的基因，這些基因的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究沙門氏菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.腸炎沙門氏菌ompR基因缺失株的構(gòu)建以及生物學(xué)特性的測定
　　 以腸炎沙門氏菌作為母本，運(yùn)用自殺性載體pGMB151構(gòu)建了ompR基因，經(jīng)RT-PCR和蛋白表達(dá)檢測證明了ompR基因缺失株構(gòu)建成功;應(yīng)用結(jié)晶紫染色法和掃描電鏡觀察法測定

5、了缺失株的生物被膜形成能力，結(jié)果表明ompR基因缺失后不形成生物被膜;經(jīng)熒光增白劑培養(yǎng)基培養(yǎng)以及卷毛蛋白的測定，進(jìn)一步證明缺失株不表達(dá)卷曲菌毛和纖維素;因此ompR基因是通過降低卷曲菌毛和纖維素的表達(dá)來調(diào)控腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。
　　 3.腸炎沙門氏菌spiA缺失株的構(gòu)建以及生物學(xué)特性的測定
　　 以腸炎沙門氏菌作為母本，運(yùn)用自殺性載體pGMB151構(gòu)建了spiA基因缺失株，同樣經(jīng)RT-PCR和蛋白表達(dá)檢測證明了s

6、piA基因缺失株構(gòu)建成功;應(yīng)用結(jié)晶紫染色法和掃描電鏡觀察法測定了缺失株的生物被膜形成能力，結(jié)果表明spiA基因缺失后生物被膜形成受抑制;經(jīng)熒光增白劑培養(yǎng)基培養(yǎng)以及卷毛蛋白的測定顯示該缺失株仍表達(dá)纖維素，但是卷曲菌毛表達(dá)顯著降低;因此spiA基因是通過降低卷曲菌毛來調(diào)控腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。
　　 4.腸炎沙門氏菌ompR-spiA雙缺失株的構(gòu)建以及生物學(xué)特性的測定
　　 以腸炎沙門氏菌作為母本，運(yùn)用自殺性載體pGM

7、B151構(gòu)建了ompR和spiA基因雙缺失株，通過RT-PCR和蛋白表達(dá)檢測證明了ompR/spiA雙基因缺失株構(gòu)建成功;ompR/spiA雙缺失株的生長速度與spiA單缺失株類似，略低于野生株，其生物膜形成能力與ompR單缺失株一樣，不形成生物被膜;經(jīng)熒光增白劑培養(yǎng)基培養(yǎng)以及卷曲菌毛蛋白的測定，進(jìn)一步證明雙缺失株不表達(dá)卷曲菌毛蛋白和纖維素。因此ompR/spiA雙缺失株的構(gòu)建為腸炎沙門氏菌毒力的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
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8、.腸炎沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因不同缺失株的毒力測定
　　 選擇野生株和ompR、spiA、ompR-spiA缺失株進(jìn)行上皮細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)以及巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)，結(jié)果顯示各缺失株與野生株在上皮細(xì)胞內(nèi)具有相同的黏附和侵入率;但在巨噬細(xì)胞內(nèi)處于生物被膜狀態(tài)缺失株增殖顯著降低;隨后進(jìn)行BALB/c小鼠腹腔攻毒試驗(yàn)測定其毒力變化，結(jié)果表明在生物膜狀態(tài)下，spiA基因缺失株以及野生株的半數(shù)致死量為107.47和10-0.03;處于

9、浮游狀態(tài)下，spiA基因缺失株以及野生株的半數(shù)致死量為107.13和100.13，ompR、ompR-spiA缺失株半數(shù)致死量為106.67CFU、107.13CFU。與野生株相比，ompR、spiA、ompR-spiA缺失株的毒力顯著下降。因此，ompR、spiA基因不僅影響生物膜的形成，而且與細(xì)菌毒力相關(guān)。
　　 6.小鼠免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)
　　 將ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS缺失

10、株通過口服方式接種6周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行毒力的測定，結(jié)果表明ompR、spiA、rpoS、ompR-spiA、ompR-rpoS缺失株的半數(shù)致死量(LD50)都大于109CFU，而野生株的LD50為105CFU。以108CFU口服接種BALB/c鼠，測定不同時(shí)間體內(nèi)細(xì)菌分布及病理變化，結(jié)果顯示野生株肝、脾、派爾氏結(jié)中的細(xì)菌數(shù)顯著上升，并在一周內(nèi)全部死亡(p＜0.05)。雙缺失株接種后在肝內(nèi)經(jīng)過一段時(shí)間逐漸被清除，而在脾、派爾氏結(jié)第

11、四周時(shí)仍可分離到一定的細(xì)菌;單缺失株在肝、脾、派爾氏結(jié)均可分離到細(xì)菌。病理組織切片顯示野生株引起肝、脾的病變嚴(yán)重，各缺失株引起的病變比較輕微。血清抗體水平測定表明，各缺失株經(jīng)口服后可使機(jī)體產(chǎn)生較高的IgG抗體，并大多數(shù)于3周達(dá)到高峰;各缺失株中僅spiA缺失株可誘導(dǎo)少量地血清IgA抗體，ompR-rpoS缺失株可誘導(dǎo)少量的黏膜IgA抗體。以100倍LD50野生株攻毒后ompR、spiA、rpoS、ompR/rpoS和ompR/spiA缺