減毒沙門氏菌介導(dǎo)的t-PA基因表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、沙門氏菌是一種侵襲性胞內(nèi)菌，可作為活載體攜帶原核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒，并能有效呈遞抗原，激發(fā)抗沙門氏菌和誘導(dǎo)外源蛋白的特異性體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能同時(shí)誘導(dǎo)粘膜免疫與全身免疫。減毒沙門菌是異源抗原的優(yōu)良載體，具有良好的侵襲力，能很好地定位于免疫組織器官中，被廣泛用于 DNA疫苗新型細(xì)菌載體的研究。沙門氏菌自身具有纖溶酶原激活活性，這種活性與其侵染性有一定的關(guān)系。組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen ac

2、tivator，t-PA)是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的、具有特異激活血栓纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶，能夠特異地激活血栓纖維上結(jié)合的纖溶酶原轉(zhuǎn)變成具有活性的纖溶酶，對(duì)于促纖溶活性引起體內(nèi)彌漫性出血的風(fēng)險(xiǎn)性小。本研究利用減毒沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)侵襲特性和口服給藥及腸壁吸收的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建攜帶 t-PA基因的重組減毒沙門氏菌，探討減毒沙門氏菌作為活載體用于表達(dá)功能基因和預(yù)防心腦血管栓塞性疾病及其康復(fù)期治療生物制劑的可行性。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)人 t-PA的編碼序

3、列設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別擴(kuò)增 t-PA目的基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28-tPA和 PYA3494-tPA及真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3-tPA。將重組質(zhì)粒 pET28-tPA和 pcDNA3-tPA分別經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入減毒沙門氏菌ΔcrpSL1344，重組質(zhì)粒 PYA3493-tPA電轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌ΔcrpΔasdSL1344，構(gòu)建重組菌?crpSL1344(pET28-tPA)、?crpSL1344(pcDNA3-tPA)和?crp

4、?asd SL1344(PYA3493-tPA)。重組菌分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 BHK細(xì)胞，SDS-PAGE檢測(cè) t-PA表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)表達(dá)水平，纖維蛋白平板溶圈法檢測(cè)纖溶活性；在此基礎(chǔ)上，重組菌分別感染昆明白小鼠，Sysmex CA-50血凝儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)、ΔcrpS

5、L1344(pET28-tPA)和ΔcrpSL1344(pcDNA3-tPA)在BHK細(xì)胞中均有66kDa的蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測(cè)證明表達(dá)的目的蛋白為t-PA；轉(zhuǎn)染96h的表達(dá)量分別為197μg/L、118μg/L和135μg/L，轉(zhuǎn)染重組菌ΔcrpΔasd SL1344(PYA3493-tPA)的細(xì)胞裂解液和轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清均有促進(jìn)溶解纖維蛋白的活性，轉(zhuǎn)染真核重組菌ΔcrpSL1

6、344(pcDNA3-tPA)較原核重組菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)的蛋白活性高，且以重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)的活性最高。在凝血四項(xiàng)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，4組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比小鼠的PT、APTT、TT都有不同程度的延長(zhǎng)；其中，轉(zhuǎn)染重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)組小鼠 PT、APTT、TT延長(zhǎng)極顯著(P<0.01)，F(xiàn)IB的含量降低極顯著(P<0.01)。研究表明