Scriptaid對水牛體細(xì)胞克隆效率的影響及其相關(guān)分子機(jī)理的研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆技術(shù)是一種具有廣闊應(yīng)用前景的家畜遺傳改良技術(shù)，故而成為當(dāng)今生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)。然而，目前體細(xì)胞克隆的效率還很低，主要表現(xiàn)在克隆胚胎發(fā)育率低，移植后妊娠率低、流產(chǎn)率高、胎盤異?；虺錾鷥后w重過大等問題，使得體細(xì)胞克隆技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。有研究表明，異常的表觀遺傳修飾是克隆胚胎效率低的主要原因，而組蛋白乙?；虳NA甲基化修飾是表觀遺傳修飾的兩個重要方面。因此，本研究系統(tǒng)探討了組蛋白去乙?；敢种苿㏒criptaid對水牛

2、體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚發(fā)育潛能及胚胎表觀遺傳修飾的影響及其對克隆胚胎合子基因激活的影響，同時(shí)研究了Scriptaid對水牛轉(zhuǎn)基因效果的影響，以期進(jìn)一步提高水牛體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因克隆的效率。具體的研究結(jié)果如下。
　　1.本研究首先采用醋酸地衣紅染色法確定了水牛卵母細(xì)胞不同成熟培養(yǎng)時(shí)間的核相分布情況，然后利用細(xì)胞免疫組化技術(shù)和定量PCR技術(shù)分別分析水牛卵母細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的情況，并探討Scriptaid對卵母細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾的影響

3、，從而建立一種檢測水牛卵母細(xì)胞組蛋白乙?；揎椣嚓P(guān)蛋白和基因表達(dá)的技術(shù)方法。結(jié)果顯示:體外成熟培養(yǎng)0h時(shí)大約91.8％的卵母細(xì)胞處于GV期，培養(yǎng)9h時(shí)，有83.3％的卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD;隨著成熟培養(yǎng)時(shí)間延長，到達(dá)15h時(shí)，卵母細(xì)胞處在MⅠ期的比率達(dá)到72.5％，培養(yǎng)至22 h時(shí)，有59.6％的卵母細(xì)胞進(jìn)入MⅡ期。水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中組蛋白H3K18乙?；綇腉V期到GVBD期開始升高，MⅠ期突然消失，MⅡ期重新升高，在第一極體

4、上也觀察到熒光信號，經(jīng)500 nmol/L Scriptaid處理水牛卵母細(xì)胞24 h，MⅠ期的卵母細(xì)胞組蛋白H3K18乙?；斤@著增強(qiáng)(P＜0.05)，呈現(xiàn)出從GV期到GVBD期開始升高，到MⅠ時(shí)期下降，而后到MⅡ期乙?；街匦律叩内厔?。而CBP，p300和HAT1基因在水牛卵母細(xì)胞成熟過程各個時(shí)期(GV，GVBD，MⅠ，MⅡ)的表達(dá)水平呈現(xiàn)出升高的趨勢，HDAC1和HDAC2基因的表達(dá)水平從GV到MⅡ期顯示出先升高后下降的波浪

5、線趨勢;而經(jīng)500 nmol/L Scriptaid處理水牛卵母細(xì)胞24 h后，CBP，p300和HAT1基因在各個時(shí)期的表達(dá)水平顯著提高(P＜0.05)，仍表現(xiàn)出上升的趨勢;HDAC2基因的表達(dá)水平在MⅡ期顯著地降低(P＜0.05)，從GV到MⅡ期表現(xiàn)出先升高后下降的波浪線趨勢，而HDAC1基因在各個時(shí)期的表達(dá)呈現(xiàn)出從GV期到MⅠ期先下降，而后到MⅡ期升高的趨勢。
　　2.研究了Scriptaid處理水牛SCNT胚胎后對其發(fā)育能

6、力及組蛋白乙?；揎椀挠绊?。水牛SCNT胚胎經(jīng)不同濃度Scriptaid(0，250，500，750 nmol/L)處理12 h后，500 nmol/L Scriptaid處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于未處理組(19.2％ vs10.3％，P＜0.05)。當(dāng)水牛SCNT胚胎用500 nmol/L Scriptaid處理不同時(shí)間(0h，6h，12h，18h，24 h，30h和36h)時(shí)，24h組的囊胚發(fā)育率(28.2％)顯著高于對照組(13.

7、6％)，6h組(15.5％)和12 h組(17.4％)。不同類型胚胎組蛋白H3K18乙?；揎椇驼wDNA甲基化修飾的細(xì)胞免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，SCNT組胚胎各個時(shí)期（2-細(xì)胞，8-細(xì)胞，桑椹胚和囊胚）的H3K18乙?；斤@著低于IVF組(P＜0.05)，而DNA甲基化的水平顯著高于IVF組和PA組的胚胎(P＜0.05)，但SCNT胚胎500 nmol/L Scriptaid處理組的各個時(shí)期組蛋白H3K18乙酰化水平顯著地高于SCNT組(

8、P＜0.05)，除8-細(xì)胞時(shí)期外，其它三個時(shí)期胚胎乙酰化水平均接近于IVF組的水平(P＞0.05)，而胚胎整體DNA甲基化修飾水平顯著地降低(P＜0.05)，且其囊胚時(shí)期胚胎DNA甲基化水平接近于IVF組(P＞0.05)。組蛋白乙?；?CBP，p300，HAT1，HDAC1和HDAC2)、DNA甲基化(Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b)和胚胎發(fā)育（Oct-4，Nanog，Cx43和Cdx2）相關(guān)基因表達(dá)水平的熒光定量PCR分析結(jié)果

9、顯示:Scriptaid處理SCNT胚胎組在8-細(xì)胞期的CBP，HDAC1和HDAC2基因表達(dá)水平接近于IVF組，Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b基因的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Dnmt1基因表達(dá)水平接近IVF組(P＞0.05);在桑椹期的Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b基因表達(dá)水平顯著地提高(P＜0.05)，Dnmt1基因和CBP基因的表達(dá)水平接近IVF組(P＞0.05);在囊胚期的Dnmt3a基因表達(dá)水平顯著降低

10、，Dnmt3a基因和HAT1基因的表達(dá)水平接近IVF組(P＞0.05)。PA組各個時(shí)期胚胎的CBP，p300，HAT1和HDAC1基因表達(dá)量處于較高水平。此外，Scriptaid處理SCNT胚胎組的各個時(shí)期胚胎的Oct-4基因表達(dá)水平顯著提高，8-細(xì)胞期和囊胚期的Nanog基因、桑椹期的Cx43基因，以及囊胚期的Cdx2基因的表達(dá)水平亦顯著高于SCNT組(P＜0.05)，接近于IVF組的表達(dá)水平。
　　3.探討了Scriptaid

11、處理水牛SCNT胚胎對其合子基因激活的影響。采用轉(zhuǎn)錄抑制劑25μg/mlα-amanition可將水牛胚胎阻滯于8-16細(xì)胞時(shí)期。透射電子顯微鏡技術(shù)觀察各個時(shí)期（4-細(xì)胞，8-細(xì)胞和桑椹期）胚胎細(xì)胞核核仁變化情況的結(jié)果顯示:IVF組胚胎在4-細(xì)胞時(shí)期核仁呈現(xiàn)出核仁前體(Nucleolus precursor body，NPB)形式，8-細(xì)胞時(shí)期NPB周圍出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，到桑椹期NPB消失，形成具有轉(zhuǎn)錄功能的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);而8-細(xì)胞時(shí)期的SCN

12、T組胚胎NPB周圍沒有形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);但經(jīng)500nmol/L Scriptaid處理水牛核移植重構(gòu)胚胎24 h，可觀察到8-細(xì)胞時(shí)期核移植胚胎細(xì)胞核中的NPB周圍出現(xiàn)低電子密度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，開始行使轉(zhuǎn)錄功能。各個發(fā)育時(shí)期（2-細(xì)胞，4-細(xì)胞，8-細(xì)胞和桑椹期）胚胎的RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibdllarin表達(dá)細(xì)胞免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IVF胚胎在2-細(xì)胞和4-細(xì)胞時(shí)期未檢測到RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibrillarin

13、熒光信號，8-細(xì)胞階段開始發(fā)現(xiàn)熒光信號，而SCNT胚胎在桑椹期才開始檢測到這兩個蛋白的熒光信號，經(jīng)Scriptaid處理的SCNT胚胎在8-細(xì)胞階段開始檢測到RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibrillarin微弱的熒光信號。胚胎合子基因激活標(biāo)志基因(eIF-3a和TRC)表達(dá)的熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示:IVF胚胎的eIF-3a和TRC基因從2-細(xì)胞到8-細(xì)胞期先升高，從8-細(xì)胞到桑椹期開始急劇地降低，而SCNT胚胎的eIF-3a基因

14、從2-細(xì)胞到桑椹期呈現(xiàn)一直降低的趨勢;經(jīng)Scriptaid處理的SCNT胚胎，除桑椹期外，其他三個時(shí)期的eIF-3a和TRC基因表達(dá)水平顯著高于IVF組和SCNT組(P＜0.05)，呈現(xiàn)出波浪形表達(dá)趨勢，在8-細(xì)胞時(shí)期表達(dá)水平最高;SCNT組以及Scriptaid處理組胚胎的TRC基因表達(dá)水平均低于IVF組。
　　4.探討了Scriptaid對水牛轉(zhuǎn)基因克隆效率的影響。水牛轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞用各種濃度(0，250，500，750

15、 nmol/L)的Scriptaid處理不同時(shí)間(0，24h，48h，72h)后，經(jīng)250 nmol/L或500 nmol/L Scriptaid處理72 h的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到的GFP熒光更強(qiáng)。熒光定量PCR的分析結(jié)果亦顯示，250 nmol/L Scriptaid處理72 h的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其GFP基因的表達(dá)水平顯著地高于其它各組的表達(dá)水平(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，250 nmol/L處理72 h組、500 n

16、mol/L處理48 h或72 h組，以及750nmol/L處理48 h組的GFP-陽性細(xì)胞比例顯著高于250 nmol/L處理48 h組、500 nmol/L和750 nmol/L處理24 h組(79.8％，80.9％，80.1％，80.8％ vs73.2％，73.1％，68.5％，P＜0.05)，但與對照組和其他處理組之間差異不顯著。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因EF-1A啟動子區(qū)的甲基化程度重亞硫酸氫鹽—測序檢測結(jié)果顯示:Scriptaid處理

17、顯著降低轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的EF-1A啟動子區(qū)甲基化水平(P＜0.05)，各處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。用經(jīng)250 nmol/L Scriptaid處理72 h的水牛轉(zhuǎn)PRL基因胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞構(gòu)建SCNT胚胎，再用500 nmol/L Scriptaid處理SCNT胚胎24 h，其囊胚發(fā)育率顯著高于對照組（31.3％ vs20.4％，P＜0.05），且其移植后的妊娠率顯著提高(22.9％ vs11.1％)，并有1頭已順利出