端粒功能缺陷細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)即人類衰老和疾病的預(yù)報(bào)因子.pdf

1、端粒的縮短限制了人類細(xì)胞的分裂增殖，因此它常見于人類組織器官的衰老過程中。在第四代端粒酶敲除小鼠中，端粒功能的缺陷致使組織器官功能受損，壽命縮短。然而，端粒功能缺陷在人類衰老和疾病中的作用目前仍存在很大的爭議。我們研究發(fā)現(xiàn)了一組蛋白質(zhì)：CRAMP、EF—1α、Chitinase 3L3、Stathmin。這組蛋白質(zhì)在老年端粒酶敲除小鼠的多個(gè)器官(如肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、大腦等)和血清中異常高表達(dá)，但是在老年野生型端粒功能正常的小鼠

2、中沒有相似的高表達(dá)發(fā)現(xiàn)。我們還發(fā)現(xiàn)，這組人類的同源蛋白質(zhì)在人類衰老過程中高表達(dá)于血清以及其他的器官中(如肝臟、脾臟等)。而且在端粒縮短相關(guān)疾病中呈過度表達(dá)(如肝臟纖維化、骨髓發(fā)育不良綜合征等)。我們將進(jìn)一步研究這組蛋白質(zhì)與腎臟疾病的關(guān)系，探索其作用機(jī)制。 端粒位于染色體末端防止由于DNA損傷激活導(dǎo)致得細(xì)胞衰老或者凋亡1.2。已經(jīng)有確鑿的證據(jù)表明端粒縮短會(huì)導(dǎo)致人類衰老和慢性疾病的發(fā)生3。且同時(shí)發(fā)現(xiàn)端粒酶基因的突變會(huì)導(dǎo)致端粒的縮短，

3、組織器官修復(fù)功能的損傷，以及人類4-7和小鼠8-11壽命的縮短。雖然大量的遺傳學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)證明端?？s短導(dǎo)致組織器官修復(fù)功能的損傷和壽命的縮短。然而，在端粒功能缺陷導(dǎo)致人類壽命縮短和疾病的機(jī)制方面仍然存在不同的爭議。在人類12和某些靈長類動(dòng)物13的衰老過程中，皮膚會(huì)有大量衰老細(xì)胞累積，但在其他例如肌肉14或者肝臟15等器官中并未發(fā)現(xiàn)此類衰老細(xì)胞累積現(xiàn)象。在衰老的端粒酶敲除小鼠中，端粒功能的缺陷還與干細(xì)胞功能的損傷相關(guān)，并導(dǎo)致器官修復(fù)功能受

4、損以及壽命縮短。8-11。然而在這種端粒酶敲除小鼠模型體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞的累積現(xiàn)象11。在這種模型小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)衰老的細(xì)胞被凋亡11和免疫反應(yīng)16清除。顯然衰老是受到細(xì)胞周期調(diào)控的17。因此端粒功能缺陷在衰老過程中的作用可以通過對(duì)衰老細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。而衰老的臨床生物學(xué)信號(hào)的研究與發(fā)現(xiàn)，對(duì)于衰老的研究領(lǐng)域更是具有劃時(shí)代的挑戰(zhàn)意義。在人類細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)端粒功能低水平缺陷就可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老18。因此如果我們能夠發(fā)現(xiàn)鑒定一

5、組蛋白質(zhì)生物學(xué)信號(hào)，它們可以在細(xì)胞衰老前期或者疾病早期就反應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)的端粒功能水平的底下和DNA損傷，那么將對(duì)人類衰老和某些衰老相關(guān)疾病的研究產(chǎn)生重要的影響。由于全球都面臨老齡化這一重要問題，人口老齡化所帶來的一系列相關(guān)疾病問題，這一組蛋白質(zhì)生物學(xué)信號(hào)的發(fā)現(xiàn)與鑒定無疑將對(duì)此意義深遠(yuǎn)。 我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第四代端粒酶敲除小鼠(G4mTerc-/-)并沒有呈現(xiàn)衰老細(xì)胞體內(nèi)累積現(xiàn)象，但是其衰老表型仍然與端粒功能缺陷密切相關(guān)8-11。我們有

6、充分理由相信這種小鼠模型能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和鑒定端粒功能缺陷誘導(dǎo)衰老前期細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)提供完善的實(shí)驗(yàn)體系。而好的臨床信號(hào)應(yīng)當(dāng)能夠易于通過體液檢測到。因此，我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體外短時(shí)間培養(yǎng)(4小時(shí))2月和12月齡的第四代端粒酶敲除小鼠以及端粒功能正常野生型小鼠的骨髓細(xì)胞，收集其培養(yǎng)液，通過蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(CE—TOF—MS)鑒別不同的蛋白質(zhì)組分泌。然后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立能夠鑒別這四組不同實(shí)驗(yàn)小鼠的蛋白質(zhì)組模型(Suppl．Fig．1a-e)。

7、 然后我們通過質(zhì)譜技術(shù)測序鑒定了一組4個(gè)蛋白質(zhì)。他們?cè)?2月齡的第四代端粒酶敲除小鼠中異常高表達(dá)，顯著區(qū)別于其他三組小鼠(n=5／組， figure 1a)。我們還設(shè)計(jì)了一個(gè)單盲實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)這組蛋白質(zhì)模型。四組共計(jì)26只小鼠用于單盲檢測，敏感度為9l％，特異性為60％。這四組小鼠骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這組蛋白質(zhì)在12月齡的第四代端粒酶敲除小鼠中異常高表達(dá)(figure 1b)。 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)這組

8、蛋白質(zhì)為：1，CRAMP-它在免疫反應(yīng)早期被激活，保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌引起的感染侵?jǐn)_19。2，Chitinase 3 like protein 3(Chi3L3)-它屬于chitinase家族，也在免疫反應(yīng)早期被激活22,21，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)它與軟骨細(xì)胞的衰老和關(guān)節(jié)炎相關(guān)22。3，Elongation factorlα (EF—1α)，它與蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)，也在人類纖維細(xì)胞的衰老中表達(dá)增加23,24. 4，Stathmin(OPl8)，

9、它與微小管的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，細(xì)胞活性和有絲分裂密切相關(guān)25。 我們同時(shí)檢測了實(shí)驗(yàn)小鼠(2月和12月齡的第四代端粒酶敲除小鼠以及端粒功能正常野生型小鼠，24月齡端粒功能正常野生型小鼠)的心臟、肝臟、腎臟、大腦、脾臟和肺臟等組織器官這組蛋白質(zhì)信號(hào)的mRNA水平表達(dá)的高低(figure 1c)。發(fā)現(xiàn)CRAMP和Chi3L3在所有12月齡第四代端粒酶敲除小鼠檢測器官mRNA水平均為高表達(dá)，而EF-1α和Stathmin則表現(xiàn)出器官特異性，僅在

10、12月齡第四代端粒酶敲除小鼠心臟和肺臟中高表達(dá)。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)這組蛋白質(zhì)信號(hào)在12月齡第四代端粒酶敲除小鼠臟器中特異性高表達(dá)(figure 1d，Suppl．Table 1，Suppl．Fig．2)。在實(shí)驗(yàn)小鼠血清ELISA檢測中我們也發(fā)現(xiàn)了這組蛋白質(zhì)信號(hào)在12月齡第四代端粒酶敲除小鼠體內(nèi)的高表達(dá)(Figure 1e)。CRAMP和Chi3L3在24月齡端粒功能正常野生型小鼠血清中還呈現(xiàn)中等量的高表達(dá)，但是并沒有在12月齡的24月齡

11、端粒功能正常野生型小鼠體內(nèi)表達(dá)量高。這組蛋白質(zhì)信號(hào)在老齡的生長激素基因缺陷小鼠體內(nèi)并沒有高表達(dá)(Suppl．Fig．3a-d)。這一結(jié)果說明這組蛋白質(zhì)信號(hào)僅與端粒功能缺陷小鼠的衰老相關(guān)。由于人類還未發(fā)現(xiàn)與小鼠Chi3L3相似同源蛋白質(zhì)，因此我們檢測體內(nèi)chitinase酶的活性來反應(yīng)人類衰老和疾病過程中chitinase的變化。我們選用體外培養(yǎng)30代、40代、50代、60代和70代的人類纖維細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，其中60代細(xì)胞是衰老前期細(xì)胞

12、，70代的細(xì)胞已經(jīng)是衰老的細(xì)胞了。mRNA水平蛋白質(zhì)水平檢測均發(fā)現(xiàn)60代和70代的細(xì)胞CRAMP、EF-1α、stathimin呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(figure3a，b)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的ELISA檢測均發(fā)現(xiàn)60代和70代的細(xì)胞CRAMP、EF-1α、stathimin和chitinase酶活性呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(figure3c-e)。這組實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示這組蛋白質(zhì)信號(hào)亦與人類細(xì)胞端粒功能缺陷和DNA損傷相關(guān)。 我們進(jìn)一步進(jìn)行人類衰老和疾病

13、組的體外檢測。發(fā)現(xiàn)這組蛋白質(zhì)信號(hào)在健康老年人體內(nèi)顯著高表達(dá)與健康年輕人，在疾病老年人則表現(xiàn)為進(jìn)一步的高表達(dá)(figure2a-d)。揭示這組蛋白質(zhì)信號(hào)在人類血清中的表達(dá)與人類的衰老和疾病密切相關(guān)。多因素回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示CRAMP和chitinase酶活性是其中作用最強(qiáng)的2個(gè)信號(hào)，將這二個(gè)蛋白質(zhì)信號(hào)進(jìn)行加權(quán)統(tǒng)計(jì)，可以更好的鑒別健康年輕組、健康老年組和疾病老年組(figure2e).我們還和傳統(tǒng)的衰老信號(hào)IL-626-28進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)

14、我們的這組蛋白質(zhì)信號(hào)比IL-6具有更高的敏感度和特異性(figure2f)。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)這些蛋白質(zhì)信號(hào)在老年器官中的高表達(dá)(Suppl．Fig．4,Suppl．Table2)。 有很多人類疾病與端?？s短相關(guān)，例如肝臟纖維化，是慢性肝臟疾病終末期功能衰竭的標(biāo)志15。纖維化患者肝臟組織的這組蛋白質(zhì)信號(hào)mRNA表達(dá)顯著高與未纖維化患者(figure3f)。血清ELISA結(jié)果亦顯示纖維化患者這組蛋白質(zhì)信號(hào)表達(dá)顯著高與未纖維化患者(

15、figure4g-k)。免疫熒光進(jìn)一步顯示纖維化患者肝臟組織這組蛋白質(zhì)信號(hào)的顯著高表達(dá)(figure4a)．骨髓增生不良綜合征MDS是另一種與端?？s短導(dǎo)致造血干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞功能衰竭相關(guān)的疾病29。MDS患者血清中這組蛋白質(zhì)信號(hào)表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(figure4b-f)。 IgA腎病也是一種與端?？s短相關(guān)的疾病。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這組蛋白質(zhì)信號(hào)的表達(dá)與IgA腎病的進(jìn)展相關(guān)，血清ELISA結(jié)果明確顯示(figure5)，免疫熒光進(jìn)

16、一步證實(shí)結(jié)果(figure5d-g)。 綜上所述，本研究從衰老的端粒酶敲除小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一組四個(gè)特異性的蛋白質(zhì)。他們與非端?？s短功能異常所致的衰老無關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)這組蛋白質(zhì)信號(hào)不僅儀是端粒缺陷小鼠的衰老信號(hào)，還是人類衰老和疾病的信號(hào)。說明了端粒的縮短在人類衰老和疾病的過程中的重要作用。 這些由于端粒功能缺陷說所釋放的蛋白質(zhì)不僅僅是人類衰老的生物學(xué)信號(hào)，還預(yù)示著在衰老和慢性疾病過程中細(xì)胞和組織器官的損壞、功能的異常。已有