高同型半胱氨酸血癥抑制血管再生的機(jī)制研究.pdf

1、高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。大量的臨床研究以及流行病學(xué)調(diào)查表明高同型半胱氨酸血癥與心血管疾病發(fā)病率密切相關(guān)。Meta分析也發(fā)現(xiàn)血清同型半胱氨酸(Hcy)每增加5μmol/L，罹忠心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加1.6-1.8倍。
　　HHcy可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和內(nèi)皮損傷后的再內(nèi)皮化，損害內(nèi)皮的舒張功能，并能加速血管內(nèi)膜的增生，同時(shí)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生。我們知道，在各種病理狀態(tài)下，血管再生的過(guò)程都參與其中。血管再

2、生是一種不同于血管發(fā)育的，在病理?xiàng)l件下受嚴(yán)格調(diào)控的血管生成，但Hcy如何影響血管再生的機(jī)制并不清楚。本課題我們研究高同型半胱氨酸血癥對(duì)血管再生的影響及機(jī)制。
　　第一部分:高同型半胱氨酸抑制血管再生
　　目的:
　　運(yùn)用多種經(jīng)典血管再生模型觀察高同型半胱氨酸血癥對(duì)血管再生的影響。
　　方法:
　　1、選用轉(zhuǎn)基因Tg-hCBS+Cbs+/-\-/-小鼠（Kruger實(shí)驗(yàn)室，費(fèi)城，賓夕法尼亞），由于其胱硫醚β合

3、成酶(CBS，cystathionine-β-synthase)缺乏，致使同型半胱氨酸代謝中轉(zhuǎn)硫基途徑受阻，血清同型半胱氨酸水平自發(fā)上升，一般可達(dá)到重度高同型半胱氨酸血癥(血清同型半胱氨酸＞115μmol/L)。乳鼠出生10日之內(nèi)進(jìn)行基因測(cè)定。
　　2、運(yùn)用多種經(jīng)典血管再生模型，觀察小鼠血管再生。2.1眼球視網(wǎng)膜血管染色:選取出生后1天，3天，7天，14天乳鼠及8-12周成年雄性小鼠，處死后摘取眼球，分離視網(wǎng)膜，免疫熒光染色視網(wǎng)膜

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞（Isolectin B4染色），激光共聚焦顯微鏡下逐層掃描，重組3D圖像，每個(gè)樣本選取3個(gè)層面計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜血管網(wǎng)長(zhǎng)度總和，比較對(duì)照組與高同型半胱氨酸血癥小鼠視網(wǎng)膜血管密度及長(zhǎng)度。2.2主動(dòng)脈環(huán)微血管生成(Aortic ring assay)。分離小鼠主動(dòng)脈(長(zhǎng)約10mm)，清理干凈周圍脂肪組織及血液，切成多個(gè)約1mm長(zhǎng)度血管環(huán)，種植于基質(zhì)膠(Matrigel)上，每日拍照并計(jì)數(shù)微血管生長(zhǎng)。
　　結(jié)果:
　　1、高

5、同型半胱氨酸血癥抑制乳鼠的視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)，同時(shí)成年小鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)血管再生也受到抑制(p＜0.05)。
　　2、高同型半胱氨酸抑制小鼠主動(dòng)脈環(huán)微血管生成。在主動(dòng)脈環(huán)接種于基質(zhì)膠的第5天，可以觀察到高同型半胱氨酸血癥組（hCBS+Cbs-/-小鼠）的主動(dòng)脈環(huán)微血管生成受抑制。主動(dòng)脈環(huán)微血管生成同時(shí)呈現(xiàn)了同型半胱氨酸濃度依賴性，隨著濃度升高，微血管生長(zhǎng)抑制加強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　高同型半胱氨酸血癥小鼠血管再生受抑制。<

6、br>　　第二部分:高同型半胱氨酸血癥致使肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)釋放減少?gòu)亩种蒲茉偕?br>　　目的:
　　探討高同型半胱氨酸抑制血管再生的分子機(jī)制
　　方法:
　　1、小管形成(Tube formation)。選取人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）以及人微小血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC-C)，傳代至第8代后，分別使用不同濃度DL-Hcy（100/200/500μm）處理細(xì)胞24小時(shí)。基質(zhì)膠(Matrigel)預(yù)先鋪板（9

7、6孔板），胰酶消化細(xì)胞后，種植于基質(zhì)膠(Matrigel)上，8小時(shí)后觀察小管形成情況，計(jì)數(shù)小管形成個(gè)數(shù)及長(zhǎng)度;
　　2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR篩查。此PCR基因篩查試劑盒包含血管再生過(guò)程中的84個(gè)主要基因，其中包括生長(zhǎng)因子及其受體，趨化因子和細(xì)胞因子，粘附因子，蛋白酶以及抑制劑和轉(zhuǎn)錄因子等。提取來(lái)自對(duì)照組以及Hcy處理組的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）總RNA，Real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá)，確定有意

8、義的上調(diào)或下調(diào)基因。
　　3、Real-Time PCR。以篩選出的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF)為目標(biāo)基因，提取HAEC/小鼠主動(dòng)脈/小鼠心臟組織總RNA，樣本分別來(lái)自細(xì)胞對(duì)照組和Hcy處理組以及8-12周齡對(duì)照組小鼠（hCBS+Cbs+/-小鼠）和高同型半胱氨酸血癥組小鼠（hCBS+Cbs-/-小鼠），設(shè)計(jì)HGF基因引物，檢驗(yàn)HGF基因表達(dá)水平在兩組間的差異。
　　4、West

9、ern blot，提取HAEC/小鼠主動(dòng)脈/小鼠心臟組織總蛋白，樣本分別來(lái)自細(xì)胞對(duì)照組和Hcy處理組以及8-12周齡對(duì)照組小鼠（hCBS+Cbs+/-小鼠）和高同型半胱氨酸血癥組小鼠（hCBS+Cbs-/-小鼠），Western blot檢驗(yàn)HGF蛋白表達(dá)水平在兩組間的差異。
　　5、建立小鼠急性心肌梗死模型。結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈，建立急性心肌梗死模型。手術(shù)2周后，處死小鼠，收集心臟組織，提取心臟總蛋白，測(cè)定組織中HGF蛋白表達(dá)水平

10、。
　　6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠血清HGF水平。外周血血清樣本收集自8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠和hCBS+Cbs-/-小鼠，使用HGF ELISA試劑盒，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度，同時(shí)收集心肌梗死2周后小鼠血清樣本，測(cè)定HGF水平。
　　7、加入HGF改善Hcy抑制的小管形成，主動(dòng)脈環(huán)微血管生成。運(yùn)用小管形成及主動(dòng)脈環(huán)微血管模型，加入不同濃度外源性人工合成HGF（50/10

11、0/150ng/ml），觀察其能否逆轉(zhuǎn)Hcy抑制的小管形成以及主動(dòng)脈環(huán)微血管形成（實(shí)驗(yàn)與觀察方法同前）。
　　結(jié)果:
　　1、Hcy抑制小管形成。經(jīng)DL-Hcy(100/200/500μm)處理(24h)后的HAEC以及HMVEC-C，小管長(zhǎng)度以及小管數(shù)量明顯減少，并呈濃度依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、血管再生基因RT2ProfilerTMPCR篩查（設(shè)定以4倍變化為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。比較對(duì)照組與Hcy處理組，在84

12、個(gè)主要基因中，Collagen，typeⅣ, alpha3(COL4A3); Epiregulin(EREG); Hepatocyte growthfactor(HGF),Interferon(IFNB1&IFNG), and Leukocyte cell derived chemotaxin1(LECT1)均顯著下調(diào)。其中Hepatocyte growth factor(HGF)下調(diào)最為顯著，為20倍下調(diào)。
　　3、Hcy下調(diào)H

13、AEC/小鼠主動(dòng)脈/小鼠心臟組織肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　4、HGF在高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死組織中的蛋白表達(dá)水平下降。提取心肌梗死后2周的心臟組織，同型半胱氨酸血癥組相較于對(duì)照組HGF蛋白表達(dá)水平明顯下降，*P＜0.05 vs hCBS+Cbs+/-+MI(n=6).
　　5、血清HGF水平在高同型半胱氨酸血癥小鼠中降低。ELISA結(jié)果表明，高同型半胱氨酸血癥小鼠的外周血血清HGF水平顯著低

14、于對(duì)照組(*P＜0.05 vshCBS+Cbs+/-(n=8))，并且心肌梗死后2周高同型半胱氨酸血癥小鼠的外周血血清HGF水平也顯著低于對(duì)照組。
　　6、人工合成外源性HGF能顯著改善Hcy抑制的小管形成以及主動(dòng)脈環(huán)微血管生成。其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外源性人工合成HGF的濃度達(dá)到100ng/ml時(shí)，開(kāi)始逆轉(zhuǎn)Hcy的抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到150ng/ml時(shí)修復(fù)作用加強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　Hcy通過(guò)抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HG

15、F)的生成與分泌從而抑制血管再生
　　第三部分:高同型半胱氨酸抑制小鼠心肌梗死后血管再生的內(nèi)皮祖細(xì)胞機(jī)制
　　目的:
　　探討內(nèi)皮祖細(xì)胞參與的高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死后的血管再生
　　方法:
　　1、測(cè)定高同型半胱氨酸血癥小鼠心肌梗死后血管再生情況。1.1小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖常規(guī)評(píng)價(jià)8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠與hCBS+Cbs-/-小鼠心功能，并取小鼠心臟切片，分別染色后計(jì)數(shù)心臟毛細(xì)血管密度;

16、1.2建立小鼠心肌梗死模型(Under the help of Dr.Gao)。結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈，建立急性心肌梗死模型（Myocardial infarction，MI），觀察心肌梗死小鼠6周后生存率，超聲心動(dòng)圖觀測(cè)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組hCBS+Cbs+/-+MI組與hCBS+Cbs-/-+MI組的心臟左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)，左室壁和室間隔厚度，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF);1.3心肌梗死第2周及第6周末，處死小

17、鼠后，取心臟，冰凍切片，行HE染色，TTC染色，觀察形態(tài)學(xué)差別;CD31（內(nèi)皮細(xì)胞）染色，計(jì)數(shù)心臟毛細(xì)血管密度;TUNEL染色，計(jì)數(shù)心肌梗死后細(xì)胞凋亡情況。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cell，EPC):流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞抗原-1(Sca-1+)以及血管生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2+)均為陽(yáng)性的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，同時(shí)檢測(cè)小鼠外周血源性(PB)EPC以及骨髓源性(

18、BM)EPC比例;2.1比較8-12周齡hCBS+Cbs+/-小鼠與hCBS+Cbs-/-小鼠之間外周血(PB)源性/骨髓(BM)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞比例以及內(nèi)皮祖細(xì)胞死亡率(violet deadcell染色);2.2比較在hCBS+Cbs+/-+MI與hCBS+Cbs-/-+MI組之間，小鼠心肌梗死后2周及6周PB/BM的EPC比例以及細(xì)胞死亡率。
　　3、骨髓源性Sca-1+細(xì)胞靜脈注射治療，對(duì)于小鼠心肌梗死后血管再生修復(fù)的作用。

19、3.1骨髓源性Sca-1+細(xì)胞的分離。選用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因工具小鼠（C57BL/6-gfp小鼠），鼠齡在6-10周不等，取得四肢長(zhǎng)骨中的骨髓細(xì)胞后，Histopaque-1083密度梯度離心法分層提取出骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclearcells，MNC)，Sca-1抗體染色MNC，將細(xì)胞用超級(jí)順磁性的MACS MicroBeads（MACS微型磁珠）特異性地標(biāo)記，置于一個(gè)強(qiáng)而穩(wěn)定磁場(chǎng)中，分選出Sca-1+細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢

20、驗(yàn)細(xì)胞分離純度;3.2建立心肌梗死模型，結(jié)扎小鼠左冠狀動(dòng)脈，關(guān)胸后，不待小鼠清醒，立即球后注射200μl預(yù)先提取的骨髓源性Sca-1+細(xì)胞(2×106/200μl)，注射后的24小時(shí)/48小時(shí)/72小時(shí)分別尾靜脈取血涂片，并球后取血200μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外源性Sca-1+細(xì)胞在體循環(huán)情況;3.3小動(dòng)物在體拍照系統(tǒng)，Sca-1+細(xì)胞球后注射后示蹤，分別于0h/22h/72h拍照，進(jìn)一步觀察細(xì)胞的去向。
　　4、Sca-1+細(xì)胞的

21、治療對(duì)于心肌梗死后血管再生的作用。4.1觀察心肌梗死小鼠經(jīng)細(xì)胞治療后的生存率，超聲心動(dòng)圖觀測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組心臟左室舒張末徑(LVEDD)，左室收縮末徑(LVESD)，左室壁和室間隔厚度，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF);4.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)建立模型后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例;4.3第2周及第6周末取各實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟，冰凍切片，IB4（內(nèi)皮細(xì)胞）染色后計(jì)數(shù)毛細(xì)血管密度。
　　結(jié)果:
　　1、高同型半胱氨酸血癥抑制小鼠心

22、肌梗死后的血管再生。8-12周齡的高同型半胱氨酸（hCBS+Cbs-/-）小鼠射血分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組（hCBS+Cbs+/-）小鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且其心臟毛細(xì)血管密度低于對(duì)照組小鼠。建立小鼠心肌梗死模型后，hCBS+Cbs-/-小鼠的生存率明顯低于對(duì)照組，幾乎很難存活，且存活的高同型半胱氨酸血癥小鼠（hCBS+Cbs-/-+MI組）射血分?jǐn)?shù)、心臟毛細(xì)血管密度均低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組。
　　2、8-12周齡高同型半胱氨酸血

23、癥小鼠(hCBS+Cbs-/-)外周血(PB)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞比例低于對(duì)照組;骨髓(BM)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞比例高于對(duì)照組，但細(xì)胞死亡率高于對(duì)照組。同時(shí)比較hCBS+Cbs+/-+MI與hCBS+Cbs-/-+MI組，兩組小鼠心肌梗死后2周及6周PB以及BM來(lái)源的EPC比例，高同型半胱氨酸組均低于對(duì)照組，且細(xì)胞死亡率均高于對(duì)照組。
　　3、骨髓源性Sca-1+細(xì)胞治療，對(duì)于小鼠心肌梗死后血管再生修復(fù)的作用。骨髓源性Sca-1+細(xì)胞純化率

24、可達(dá)85％左右，球后注射細(xì)胞24h后，GFP+細(xì)胞占外周血的1.75％，72h后，下降至0.65％;在體動(dòng)物拍照示蹤可見(jiàn)細(xì)胞球后注射6h后大多聚集于肝臟和胸腔，22h后大部分聚集在心腔。經(jīng)過(guò)骨髓源性Sca-1+細(xì)胞靜脈注射治療，高同型半胱氨酸血癥組（hCBS+Cbs-/-）小鼠以及對(duì)照組(hCBS+Cbs+/-)小鼠心肌梗死后生存率均得到提高，hCBS+Cbs-/-小鼠組6周生存率從12.5％上升到27.3％，hCBS+Cbs+/-小鼠

25、組從62.5％上升到80％，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hCBS+Cbs-/-小鼠組6周末左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)由19.3％上升到38.5％，對(duì)照組由31.6％上升至50.9％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;流式細(xì)胞儀檢測(cè)MI+細(xì)胞治療后2周/4周/6周的PB/BM EPC比例顯示:對(duì)照組（hCBS+Cbs+/-）小鼠中，接受細(xì)胞治療后外周血EPC比例顯著增高，由單純心肌梗死模型（2周末）的0.46％，上升到0.76％，hCBS+Cbs-/-小鼠組也從0.3