高同型半胱氨酸血癥誘發(fā)心血管疾病機制與茶及其提取物干預(yù)作用的研究.pdf

1、該課題從以下6個方面進(jìn)行了研究.第一部分建立高蛋氨酸飼料致大鼠早期動脈粥樣硬化模型;為了觀察高同型半胱氨酸血癥對血管的損傷作用以及進(jìn)一步探討其損傷機制,首先應(yīng)用高蛋氨酸飲食建立早期動脈粥樣硬化模型.SD大鼠隨機分為正常對照組(AOAC飼料)和高蛋氨酸組(添加3％蛋氨酸).16周后檢測血清膽固醇、脂肪、內(nèi)皮素、一氧化氮含量,并進(jìn)行主動脈病理學(xué)光鏡檢查.第二部分高蛋氨酸飼料對血管細(xì)胞衰老作用的研究;為了解上述模型中是否存在血管細(xì)胞衰老,取該

2、動物模型的主動脈進(jìn)行病理學(xué)電鏡檢查,并進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色,端粒長度分析等衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測.結(jié)果顯示,高蛋氨酸組大鼠的主動脈層次不清,內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、溶酶體增多;β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞增多;端粒長度縮短等衰老表現(xiàn)這表明高蛋氨酸飼料誘發(fā)的動脈粥樣硬化模型中有加速衰老的現(xiàn)象.第三部分體外同型半胱氨酸促進(jìn)血管細(xì)胞衰老的研究;為了探討同型半胱氨酸促進(jìn)血管細(xì)胞衰老的機制,需要建立同型半胱氨酸促進(jìn)血管細(xì)胞衰老的體外模型.分離

3、培養(yǎng)新生牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、平滑肌細(xì)胞(SMC).DMEM培養(yǎng)液中分別加入HCY,EC試驗組終濃度為0.1、0.5和1.0mmol/L,對照組為0mmol/L;SMC試驗組終濃度為1.0、5.0和10.0mmol/L對照組為0mmol/L.連續(xù)體外培養(yǎng)30d,觀察細(xì)胞形態(tài)、衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,Southern雜交分析端粒長度等衰老相關(guān)指標(biāo),同時檢測EC培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)含量

4、等功能性指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度HCY組與對照組相比,出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞體積增大,胞內(nèi)顆粒增多;β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞增多;細(xì)胞周期的分布發(fā)生改變;端?？s短:EC培養(yǎng)液中NO濃度降低,ET含量升高.該實驗證實同型半胱氨酸體外能夠促進(jìn)管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞衰老,降低細(xì)胞功能.第四部分同型半胱氨酸影響血管內(nèi)皮細(xì)胞端粒酶活性及逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá);為進(jìn)一步探討同型半胱氨酸促進(jìn)血管細(xì)胞衰老的機制,銀染端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法檢測EC的端粒酶活性;半定量RT-P

5、CR檢測端粒酶催化亞基TERT-mRNA的表達(dá).結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCY組EC端粒酶活性降低,TERT mRNA表達(dá)呈陰性.說明同型半胱氨酸促進(jìn)血管細(xì)胞衰老的機制可能是通過下調(diào)端粒酶活性,抑制TERTmRNA表達(dá)的途徑.第五部分同型半胱氨酸對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的調(diào)控;為了深入探討同型半胱氨酸對端粒酶活性抑制的機制,體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC-304),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶不同長度的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子報告質(zhì)粒pGL3B-T

6、RTP、pBT-SE、pBTdel-130分別與SV40(內(nèi)參照)共轉(zhuǎn)染,12h后在培養(yǎng)液中加入1.0mmol/L(試驗組)和0mmol/L HCY(對照組),分別在5min,以及0.5、1.5、4、12和24h檢測其報告基因熒光素酶活性.第六部分茶水浸出液和茶多酚抑制高蛋氨酸飼料對血管衰老作用及其機制的研究;實驗大鼠隨機分為4組,正常飲食對照組(C組)、高蛋氨酸組(M組,含蛋氨酸3％)、茶水浸出液組(含3％茶)和茶多酚組(200mg/