中國人PINX1、caspase-8基因遺傳不穩(wěn)定性及臨床病理特性的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：惡性腫瘤起病隱匿,微小癌灶的浸潤和轉(zhuǎn)移難以及時探查和治療,是患者生存率低的主要原因。為此,闡明腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移的機制,確立可靠的預后指標和治療靶點極為重要。研究發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的發(fā)生,腫瘤細胞內(nèi)抑癌蛋白的表達量減少,逐漸失去對腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移的抑制,表現(xiàn)為腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。而抑癌基因的失活是編碼蛋白量減少的重要機制之一。為揭示抑癌基因失活的機理,國內(nèi)外針對P53、P16等抑癌基因作了大量研究,結(jié)果表明基因的遺傳不穩(wěn)定性

2、改變,即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instablility,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),可能是產(chǎn)生基因突變,導致抑癌基因功能失調(diào),引起腫瘤發(fā)生的重要因素。微衛(wèi)星是由2～6個核苷酸組成,具有高度多態(tài)性的簡單串聯(lián)核苷酸重復序列。MSI是指由于復制錯誤導致微衛(wèi)星的增多或減少。LOH是指一個位點上兩個多態(tài)性的等位基因中的一個出現(xiàn)缺失或變異。大量研究表明,抑癌基因MSI與LOH

3、在腫瘤的多步驟發(fā)生過程中起著重要的作用。MSI首先是在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(heredity non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)中發(fā)現(xiàn)的,隨后在各種散發(fā)性腫瘤,如大腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)MSI。研究表明MSI的發(fā)生提高了基因的隨機突變率,更重要的是導致了腫瘤相關(guān)基因的突變,可能是引起腫瘤發(fā)生的一個重要機制。若DNA復制錯誤的結(jié)果是等位基因片段的缺失,則導致LO

4、H的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),與抑癌基因相關(guān)的雜合性微衛(wèi)星位點常伴有等位基因的丟失,即LOH的發(fā)生。所以,分析LOH已成為目前檢測抑癌基因失活、發(fā)現(xiàn)和定位新的腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene,TSG)的重要手段之一。PINX1(Pin2/TRF1—interacting protein X1)是新發(fā)現(xiàn)的端粒酶和端粒的共調(diào)控基因,也是一種重要的腫瘤抑制基因,定位于染色體的8p23,由7個外顯子組成,有兩種轉(zhuǎn)錄形式,分別編碼1

5、74個氨基酸和328個氨基酸,其中pinx1—328含有兩個結(jié)構(gòu)域,一個是G—patch,常見于RNA結(jié)合蛋白或損傷修復因子;另一個是端粒抑制域(telomerase inhibitory domain,TID)。PINX1在正常人體組織中正常存在,而在腫瘤組織中則相應的低表達或不表達。研究PINX1基因遺傳不穩(wěn)定性與胃癌臨床病理特性的關(guān)系,對于了解胃癌在發(fā)生、發(fā)展過程中的各種分子事件,探討胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機制,具有重要意義。Emi等曾

6、經(jīng)報道了染色體8p在結(jié)直腸癌(colorectalcarcinomal,CRC),肝細胞癌(hepatocellular carcinomas,HCC)和肺癌中LOH的發(fā)生率較高。而該基因的遺傳不穩(wěn)定性在胃癌中研究較少,更無中國人的研究資料。多種研究證明,凋亡機制的失調(diào)參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,caspase是執(zhí)行細胞凋亡程序中的一種同型半胱氨酸蛋白酶類,絕大多數(shù)的細胞凋亡依賴于caspase的存在。迄今已發(fā)現(xiàn)14種caspases形成一

7、個家族,在實施凋亡過程中起關(guān)鍵作用,casepase-8在腫瘤細胞的凋亡初期發(fā)揮了重要的作用。國內(nèi)的文獻大多限于研究caspase家族引起細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制及其相關(guān)的藥物應用。caspase-8定位于2q33-34,在成神經(jīng)細胞瘤中,這是一個易發(fā)生缺失的區(qū)域,它的表達缺失與該區(qū)域的等位基因不平衡性有著顯著相關(guān)性,表明caspase-8可能是一種侯選腫瘤抑制基因。隨后發(fā)現(xiàn)該基因在結(jié)腸癌中也同樣發(fā)生了體細胞突變。最近的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌中

8、同樣存在caspase-8的失活,更重要的是,還發(fā)現(xiàn)caspase-8在進展期的胃癌中的突變率高于早期胃癌。經(jīng)過比較結(jié)腸癌與胃癌中caspase-8的凋亡活動,發(fā)現(xiàn)其有類似的機制。這些研究表明caspase-8對胃癌與結(jié)直腸癌的發(fā)病機理發(fā)揮著重要作用,而有關(guān)該基因遺傳不穩(wěn)定性的研究,尚未見報道。研究目的研究PINX1基因D8S277位點,caspase-8基因D2S116位點的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instabl

9、ility,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)對其蛋白表達的影響,闡明基因遺傳不穩(wěn)定性與胃癌腫瘤進展的關(guān)系,為揭示抑癌基因作用機制和腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,提供實驗依據(jù)。
　　研究方法：(1)苯酚-氯仿抽提法,提取石蠟包埋的胃癌組織基因組DNA。(2)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、常規(guī)銀染檢測位點的遺傳不穩(wěn)定性。(3)Envision免疫組織化學染色檢測蛋白表達。(4)Leica-Qwin

10、計算機圖像分析蛋白表達。(5)SPSS軟件統(tǒng)計分析相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：(1)胃癌PINX1基因遺傳不穩(wěn)定性及腫瘤臨床病理特性的相關(guān)性研究①90例胃癌中D8S277位點LOH發(fā)生率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(18.57％),明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.00%,P<0.01);在胃癌TNMⅢ+Ⅳ期(21.43%),顯著高于Ⅰ+Ⅱ期(2.94%,P<0.01)。②MSI發(fā)生率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(10.00%),明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(30.00%,

11、P<0.05,Fisher’s exact test);在高分化的胃癌中檢出率(60.00%),明顯高于中分化胃癌(9.80%,P<0.05),也明顯高于低分化胃癌(14.71%,P<0.05);浸潤至粘膜和肌層的胃癌MSI檢出率(50.00%),顯著高于浸潤至漿膜外組織的4.55%(P<0.01),浸潤至漿膜層的胃癌MSI檢出率(35.71%),也顯著高于浸潤至漿膜外組織的4.55%(P<0.01)。③PINX1蛋白陽性率在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

12、移組(85.00%),明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(50.00%,P=0.005<0.01);TNM分期Ⅰ+Ⅱ期(76.47%),明顯高于Ⅲ+Ⅳ期(46.43%,P<0.01);年齡在40-60歲之間的胃癌病人中PINX1蛋白陽性率為43.75%,顯著低于60歲以上的病人的65.52%(P<0.05)。④此外,蛋白表達陽性組中LOH發(fā)生率(1.92%)顯著低于蛋白表達陰性組(31.58%,P<0.01)。(2)胃癌caspase-8基因遺傳不

13、穩(wěn)定性研究:90例胃癌D2S116位點的SSCP分析中,均未出現(xiàn)MSI或LOH。
　　結(jié)論：PINX1基因的遺傳不穩(wěn)定性可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的一個機制,MSI和LOH通過不同的途徑調(diào)控胃癌的發(fā)生和發(fā)展。LOH在PINX1表達缺失的過程中起了重要作用,可作為胃癌惡化及進展的一個指標,MSI則影響到腫瘤的預后及轉(zhuǎn)歸,二者對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PINX1蛋白表達的影響,表明PINX1不僅是個腫瘤抑制基因,而且是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。在胃癌的發(fā)生發(fā)展