原發(fā)性肝膽腫瘤nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特性相關(guān)性的研究.pdf

1、肝膽惡性腫瘤起病隱匿,早期缺乏典型癥狀,微小癌灶的浸潤和轉(zhuǎn)移難以及時探查和治療,是患者生存率低的主要原因.為此,揭示肝膽腫瘤發(fā)病機(jī)制和腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移機(jī)制,尋找有效的治療靶點(diǎn)和確立可靠的預(yù)后指標(biāo),是當(dāng)前腫瘤的研究熱點(diǎn),也是腫瘤防治的關(guān)鍵問題之一. 研究發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的發(fā)生,腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑癌蛋白的表達(dá)量減少,逐漸失去對腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的抑制,表現(xiàn)為腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移.而抑癌基因的失活是編碼蛋白量減少的重要機(jī)制之一.為揭示抑癌

2、基因失活的機(jī)理,國內(nèi)外針對P53、P16、FHIT等抑癌基因作了大量研究,結(jié)果表明基因的遺傳不穩(wěn)定性改變,其主要表型特征即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instablility,MSI)和雜合性缺失(lossof heterozygosity,LOH),可能是產(chǎn)生基因突變,導(dǎo)致抑癌基因功能失調(diào),引起腫瘤發(fā)生的重要因素. 微衛(wèi)星是由2-6個核苷酸組成,具有高度多態(tài)性的簡單串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列.MSI是指由于復(fù)制錯誤導(dǎo)

3、致微衛(wèi)星的增多或減少,使得DNA結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變,目前被認(rèn)為是發(fā)生腫瘤危險性可檢測的指標(biāo)之一.LOH是指一個位點(diǎn)上兩個多態(tài)性的等位基因中的一個出現(xiàn)缺失或變異,是腫瘤細(xì)胞抑癌基因存在的標(biāo)志.大量研究表明,抑癌基因MSI與LOH在腫瘤的多步驟發(fā)生過程中起著重要的作用.MSI首先是在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(heredity non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)中發(fā)現(xiàn)的,后在各種散發(fā)性腫瘤如大

4、腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)MSI.研究表明MSI的發(fā)生與DNA復(fù)制過程中的"鏈滑"有關(guān),從而導(dǎo)致DNA序列的改變,提高了基因隨機(jī)突變率,更重要的是導(dǎo)致了腫瘤相關(guān)基因的突變,可能是引起腫瘤發(fā)生的一個重要機(jī)制.若DNA復(fù)制錯誤的結(jié)果是等位基因片段的缺失,則導(dǎo)致LOH的發(fā)生.研究發(fā)現(xiàn)與抑癌基因相關(guān)的雜合性微衛(wèi)星位點(diǎn)常伴有等位基因的丟失,即LOH的發(fā)生.所以分析LOH已成為目前檢測抑癌基因失活、發(fā)現(xiàn)和定位新的腫瘤抑制基因

5、的重要手段之一. nm23H1基因定位于17號染色體長臂(17q21.3),是一種重要的抑癌基因.Steeg等在對鼠黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn),nm23H1基因編碼的蛋白產(chǎn)物具備核苷二磷酸激酶(NDPK)活性,可影響微管蛋白多聚化和細(xì)胞骨架形態(tài),參與細(xì)胞分裂時紡錘體的形成和GTP介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑,從而影響細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化及運(yùn)動,達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的.因此,nm23H1基因被稱為"腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因",并對其抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理進(jìn)行了

6、大量研究.但目前多集中于nm23H1蛋白/核苷二磷酸激酶(NDPK)表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究上,而針對有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤時nm23H1基因的遺傳學(xué)不穩(wěn)定性研究,尚鮮見報道. 研究目的:研究原發(fā)性惡性肝膽腫瘤中D17S396位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstablility,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),對腫瘤nm23H1基因蛋白表達(dá)的影響,闡明nm23H1基因遺傳

7、不穩(wěn)定性與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系,為揭示抑癌基因作用機(jī)制和腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 研究方法:(1)石蠟包埋組織抽提DNA. (2)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP),常規(guī)銀染顯示條帶. (3)Envision免疫組織化學(xué)檢測. (4)Leica-Qwin計算機(jī)圖像分析技術(shù).(5)SPSS軟件統(tǒng)計分析. 研究結(jié)果: (1)原發(fā)性膽囊腫瘤nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特性的相關(guān)性研究: ①在本實(shí)驗(yàn)中,原發(fā)

8、性膽囊癌D17S396位點(diǎn)遺傳不穩(wěn)定發(fā)生率為42.55﹪,明顯高于良性膽囊腫瘤的13.04﹪,而在膽囊炎組織中,未見該位點(diǎn)遺傳不穩(wěn)定的發(fā)生.其中,LOH的發(fā)生率,隨組織惡性程度的增高而增加(P<0.05).在膽囊癌中,LOH和MSI發(fā)生率與腫瘤組織分化程度有關(guān),差異具有顯著性(P<0.05);LOH的發(fā)生率,在肝臟浸潤組和淋巴轉(zhuǎn)移組高于無肝臟浸潤組和無淋巴轉(zhuǎn)移組,在NevinⅣ+Ⅴ期高于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期(P<0.01);而MSI發(fā)生率則相反

9、.②nm23H1蛋白陽性率在膽囊癌、膽囊良性腫瘤和炎癥組織中分別為46.81﹪、26.09﹪和10﹪(P<0.05),在膽囊癌中,nm23H1蛋白陽性率在淋巴轉(zhuǎn)移組低于無淋巴轉(zhuǎn)移組(P<0.01);NevinⅣ+Ⅴ期低于Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期(P<0.05).此外,計算機(jī)圖像定量分析顯示,在各臨床病理參數(shù)影響下,nm23H1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度沒有差異.③在膽囊癌中,LOH陽性組中nm23H1蛋白陽性率為11.11﹪,顯著低于LOH陰性組的55.26﹪

10、,兩者差異顯著(P<0.05). (2)肝細(xì)胞癌nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特性的相關(guān)性研究: ①48例肝細(xì)胞癌D17S396位點(diǎn)遺傳不穩(wěn)定性的發(fā)生率為35.42﹪.LOH的發(fā)生率在有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或門靜脈栓的癌組織中有顯著差異(P<0.01),臨床TNM分期Ⅲ期LOH的發(fā)生率顯著高于Ⅰ、Ⅲ期(P<0.01).此外,在侵襲轉(zhuǎn)移高危組LOH的發(fā)生率顯著高于侵襲轉(zhuǎn)移低危組(P<0.01).MSI檢

11、出率與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)均無關(guān).②nm23H1蛋白陽性率為56.25﹪,nm23H1蛋白陽性率在Edmondson分級Ⅲ+Ⅳ組低于Ⅰ+Ⅱ組(P<0.01),在有淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組顯著低于無淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(P<0.01), TNM分期Ⅲ期顯著低于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.01);在侵襲轉(zhuǎn)移高危組中nm23H1蛋白陽性率顯著低于侵襲轉(zhuǎn)移低危組(P<0.01).此外,計算機(jī)圖像定量分析顯示,在各臨床病理參數(shù)影響下,nm23H1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度沒有差異

12、.③LOH陽性組中nm23H1蛋白陽性率為27.27﹪,顯著低于LOH陰性組64.86﹪,兩者差異顯著(P<0.05). 結(jié)論: nm23Hl基因的遺傳不穩(wěn)定性可能是肝膽腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要機(jī)制.nm23H1基因LOH的發(fā)生多在肝細(xì)胞癌、膽囊癌的晚期階段,可作為肝膽組織惡變的判斷指標(biāo);MSI和LOH通過相互獨(dú)立的途徑調(diào)控肝膽腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移;后者可抑制肝膽腫瘤局部nm23Hl蛋白的陽性表達(dá),并賦予肝膽腫瘤高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移