K-ATP通道開放劑埃他卡林的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、K-ATP通道開放劑埃他卡林的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量眾多的一大類細(xì)胞群體，其在維持神經(jīng)電活動正常環(huán)境、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝、保護(hù)神經(jīng)元及促神經(jīng)再生和修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。大量研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙能夠影響神經(jīng)元的存活，與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。 PD是一類嚴(yán)重影響老年人身心健康和生活質(zhì)量的神經(jīng)退行性疾病。PD的主要病理學(xué)改變是DA

2、能神經(jīng)元的退行性病變。盡管已經(jīng)提出線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、興奮性毒性、遺傳因素和炎癥等病理機(jī)制參與DA能神經(jīng)元死亡，但導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性、死亡的確切病理機(jī)制目前仍不清楚。在PD患者和MPTP造模動物腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)均存在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧和炎性因子，這些毒性物質(zhì)促發(fā)神經(jīng)元變性，促進(jìn)了PD的發(fā)生發(fā)展。同時，PD等神經(jīng)退行性疾病中星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡則進(jìn)一步影響神經(jīng)元的存活，參與PD的病理過程。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦

3、內(nèi)氧自由基的清除過程中發(fā)揮著重要作用，而且，星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元內(nèi)谷胱甘肽的合成提供前體物質(zhì)。因此PD病變中，星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化能力下降及其發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷，都會加劇病程的發(fā)展。包括本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的研究工作表明，保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞、維持其正常功能是神經(jīng)保護(hù)的重要新策略。 ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channels．K-ATP通道)是一類耦聯(lián)細(xì)胞電活動和代謝、以細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP水平為門控

4、因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道。近年來，包括本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的研究表明：K-ATP通道特別是線粒體 ATP敏感性鉀通道(mitoK-ATP通道)與PD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是PD臨床治療學(xué)研究和研發(fā)治療藥物的新靶標(biāo)。mitoK-ATP通道位于線粒體內(nèi)膜上，其開放可調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)體積，維持線粒體功能正常，進(jìn)一步保護(hù)了整個細(xì)胞和機(jī)體組織。因此，能透過血腦屏障的K-ATP通道開放劑是富于治療學(xué)潛力的神經(jīng)保護(hù)劑。新型K-ATP通道開放劑埃他卡林

5、(iptakalim，IPT)是我國學(xué)者設(shè)計、合成的脂肪仲胺類小分子化合物。IPT易透過血腦屏障、在不擴(kuò)張血管和降低血壓的劑量時即可產(chǎn)生確切的神經(jīng)保護(hù)作用，使得應(yīng)用整體動物模型評價K-ATP通道開放劑的神經(jīng)保護(hù)作用成為可能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，IPT不僅對急慢性腦缺血損傷具有確切的神經(jīng)保護(hù)作用，而且對應(yīng)用多種神經(jīng)毒素如6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、魚藤酮(Rotenone，Rot)等制備的PD整體動

6、物模型和神經(jīng)元損傷都具有保護(hù)作用。然而，IPT的神經(jīng)保護(hù)作用是否與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能以及線粒體功能相關(guān)，目前仍不清楚。本文研究工作應(yīng)用 1-甲基-4-苯基．吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP<'+>)制備PD模型，首先整體研究IPT對MPP<'+>致PD模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其對腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響；第二部分離體研究IPT對MPP<'+>誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、凋亡和抗氧化能力下降的影響，探討

7、IPT對星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制；第三部分提取星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體，研究IPT對MPP<'+>誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體功能障礙的保護(hù)作用及其機(jī)制。 第一部分 埃他卡林對MPP<'+>制備的帕金森模型鼠的神經(jīng)保護(hù)作用 目的：研究、闡明IPT對MPP<'+>制備的PD模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：大鼠單側(cè)紋狀體立體定位注射MPP<'+>制備PD大鼠模型，手術(shù)后第7天開展?jié)L軸實(shí)驗(yàn)觀察大鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)功能；行為學(xué)實(shí)

8、驗(yàn)后，灌注動物并取腦，免疫組織化學(xué)法檢測黑質(zhì)部TH、GFAP和ED1陽性細(xì)胞；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定外周血中TNF-α的含量。 結(jié)果：單側(cè)紋狀體立體定位注射MPP<'+>誘發(fā)大鼠產(chǎn)生運(yùn)動協(xié)調(diào)功能障礙；與偽手術(shù)組相比，模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元顯著缺失，其數(shù)量為偽手術(shù)組的45％；損毀側(cè)黑質(zhì)部星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化。預(yù)先給予IPT(1.5 mg·kg<'-1>·day<'-1>，3.0mg·kg<'-

9、1>·day<'-1>)或Diazoxide(3.0 mg·kg<'-1>·day<'-1>)顯著改善MPP<'+>導(dǎo)致的大鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)功能障礙，減少黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元的缺失；IPT和Diazoxide能夠抑制MPP<'+>誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并且抑制外周血TNF-α水平的升高。 結(jié)論：預(yù)先給予IPT顯著緩解MPP<'+>誘導(dǎo)的大鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)功能障礙，促進(jìn)黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元存活。IPT發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與抑制MPP

10、<'+>誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少炎癥因子的生成有關(guān)。 第二部分 埃他卡林改善MPP<'+>導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能損傷 目的：研究、闡明IPT對MPP<'+>所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、抗氧化能力下降以及活化的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。 方法：培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，Hoechst 33342熒光染色和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡；JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位；Western-blotting法測定p38/MAPK、JN

11、K/MAPK、AIF、細(xì)胞色素C和ERK/MAPK的表達(dá)變化；改良Tietze法測定谷胱甘肽含量；硝基苯胺生成法測定γGT活性；ELISA法測定TNF-α含量。 結(jié)果：1)MPP<'+>誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位降低以及隨后致凋亡因子的釋放，上調(diào)JNM/MAPK磷酸化水平，抑制ERK/MAPK的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；IPT和Diazoxide抑制,MPP<'+>的上述作用，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。mitoK-ATP通道阻斷劑

12、5-HD取消IPT和Diazoxide的抗凋亡作用。2)MPP<'+>降低星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GSH的水平，抑制γGT的活性；IPT或Diazoxide單獨(dú)作用均增加星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)OSH的水平；IPT或Diazoxide還能夠抑制MPP<'+>降低GSH水平的作用，該效應(yīng)被5-HD逆轉(zhuǎn)；但I(xiàn)PT和Diazoxide對γGT的活性無顯著影響。3)MPP<'+>誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放TNF-α，上調(diào)p38/MAPK磷酸化水平；IPT(10μM)

13、或Diazoxide(100μM)通過抑制MPP<'+>誘導(dǎo)的p38/MAPK磷酸化，減少TNF-α的生成。IPT和Diazoxide的上述作用均被選擇性mitoK-ATP通道阻滯劑5-HD(250μM)拮抗。 結(jié)論：IPT抑制MPP<'+>誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、抗氧化能力下降以及活化，改善了星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。 第三部分 埃他卡林改善MPP+導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體功能障礙 目的：研究、闡明：IPT對MPP<

14、'+>所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體功能障礙的影響。 方法：提取星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體，給予藥物干預(yù)，Western-blotting法測定線粒體內(nèi)和釋放的細(xì)胞色素C含量的變化；氧電極法測定星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呼吸功能；熒光素酶法檢測線粒體ATP的含量；熒光酶標(biāo)儀檢測線粒體內(nèi)ROS的含量；比色法檢測復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的活性變化。 結(jié)果：MPP<'+>(50 μM)與星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體孵育30 min導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放和ROS的生

15、成增加、線粒體呼吸功能下降、ATIP生成減少和線粒體復(fù)合物I和IV的活性降低；IPT(10μM)或Diazoxide(10μM)改善MPP<'+>誘導(dǎo)的線粒體呼吸功能障礙、增加ATP的生成、降低ROS的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞色素C從星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)的釋放，mitoK-ATP通道阻滯劑5-HD(50μM)部分拮抗該作用；IPT抑制MPP<'+>誘導(dǎo)的線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性的下降。Diazoxide只能抑制MPP<'+>誘導(dǎo)的線粒體復(fù)合物Ⅰ活性

16、的下降，對復(fù)合物Ⅳ的活性無顯著影響。PT和Diazoxide的上述作用均不能被5-HD拮抗。 結(jié)論：IPT通過開放mitoK-ATP通道和調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合物活性，改善MPP<'+>誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體功能障礙。 綜上所述，本文研究工作的主要創(chuàng)新之處在于： 1．發(fā)現(xiàn)K-ATP通道參予調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能，為星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的治療提供了有益的思路。 2．發(fā)現(xiàn)IPT通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)