SIGIRR對重癥急性胰腺炎腹水刺激巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路的影響.pdf

1、背景與目的：
　　 重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis SAP)患者腹水中含有的酶類、炎癥細(xì)胞因子和內(nèi)毒素,這些毒性物質(zhì)在SAP的早期階段即可引起全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome SIRS),多器官功能衰竭(multi-organ fuction failure MOF),甚至患者的死亡。單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路的激活可誘導(dǎo)

2、促炎因子的產(chǎn)生,這在SIRS和MOF發(fā)病中起重要作用。SIGIRR是TLRs信號的負(fù)性調(diào)控因子,它可抑制LPS誘導(dǎo)的TLRs信號通路的激活及其所致的炎癥反應(yīng)。在SAP的發(fā)生發(fā)展過程中SIGIRR是否起作用,目前未見報(bào)道。為此,本文以SIGIRR低表達(dá)和高表達(dá)的巨噬細(xì)胞為研究載體,研究胰源性腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路的影響及SIGIRR對其的調(diào)控。為以SIGIRR為靶點(diǎn)防治SAP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　

3、 (1)SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路和SIGIRR的影響:
　　 用不同濃度的SAP患者腹水刺激小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7,實(shí)驗(yàn)分組如下:①對照組:巨噬細(xì)胞+1640培養(yǎng)基；②實(shí)驗(yàn)組1:巨噬細(xì)胞+含1.25％SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；⑨實(shí)驗(yàn)組2:巨噬細(xì)胞+含2.5％SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；④實(shí)驗(yàn)組3:巨噬細(xì)胞+含5％SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；⑤實(shí)驗(yàn)組4:巨噬細(xì)胞+含10％SAP患者腹水的164

4、0培養(yǎng)基；分別在刺激后6h、12h、24h收集細(xì)胞。
　　 (2)基因轉(zhuǎn)染:
　　 以未轉(zhuǎn)染SIGIRR基因的巨噬細(xì)胞株Raw264.7為SIGIRR低表達(dá)株,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pUNO-mSIGIRR轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞,構(gòu)建SIGIRR高表達(dá)細(xì)胞株。
　　 (3)SIGIRR對SAP患者腹水刺激的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路的影響:
　　 選擇SAP患者腹水刺激的最佳濃度和最佳時(shí)間點(diǎn)(5％濃度,作用24h),

5、實(shí)驗(yàn)分組如下:①對照組1:巨噬細(xì)胞+1640培養(yǎng)基；②對照組2:轉(zhuǎn)染了空白對照質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞+1640培養(yǎng)基:③對照組3:轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞+1640培養(yǎng)基；④實(shí)驗(yàn)組1:巨噬細(xì)胞+含SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；⑤實(shí)驗(yàn)組2:轉(zhuǎn)染了空白對照質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞+含SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；⑥實(shí)驗(yàn)組3:轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞+含SAP患者腹水的1640培養(yǎng)基；作用24h后分別收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清。
　　 (4)檢

6、測方法:
　　 ①用RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)SIGIRR、TLR2、TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表達(dá)；②用雙抗體夾心ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ的含量。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路和SIGIRR mRNA表達(dá)的影響:
　　 ①SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)S

7、IGIRR mRNA表達(dá)的影響:在12h和24h時(shí),各組巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA的表達(dá)隨著SAP患者腹水濃度的增加而逐漸降低(P<0.05),而6h時(shí)各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；SAP患者腹水作用不同時(shí)間對巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA的表達(dá)無影響(P>0.05)。
　　 ②SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA表達(dá)的影響:在12h和24h時(shí),各組巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)隨著SAP患者腹水濃度

8、的增加而逐漸升高(P<0.05),而6h時(shí)各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在實(shí)驗(yàn)組2、3、4巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長而逐漸升高(P<0.05)。
　　 ③SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA表達(dá)的影響:在24h時(shí),巨噬細(xì)胞內(nèi)MyD88、IRAK-1、TRAF-6 mRNA的表達(dá)隨著SAP腹水濃度的增加而逐漸升高(P<0.05),而6h和12h時(shí)各組間比較

9、均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；SAP患者腹水作用不同時(shí)間對巨噬細(xì)胞內(nèi)MyD88、IRAK-1、TRAF-6mRNA的表達(dá)無影響(P>0.05)。
　　 ④SAP患者腹水對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA表達(dá)的影響:在各時(shí)間點(diǎn),各組巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA的表達(dá)各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)SIGIRR對SAP患者腹水刺激的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs信號通路的影響:
　　 ①SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染

10、和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA表達(dá)的影響:未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞,經(jīng)SAP患者腹水作用后其SIGIRR mRNA的表達(dá)均顯著低于對照組(P<0.05),而轉(zhuǎn)染TSIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA的表達(dá)兩組之間比較無顯著差異(P>0.05)；無論是對照組還是在實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA的表達(dá)均顯著高于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞(P<0.05)。
　　 ②

11、SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA表達(dá)的影響:未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞,經(jīng)SAP患者腹水作用后其TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表達(dá)均高于對照組(P<0.05),而轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF-6mRNA的表達(dá)兩組之間比較無顯著差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)T

12、LR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表達(dá)低于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞(P<0.05,P<0.001),但對照組轉(zhuǎn)染SIGIRR對TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF-6 mRNA的表達(dá)無影響(P>0.05)。
　　 ③SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA表達(dá)的影響:SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA的表達(dá)均無影響(P>0.05

13、)；同時(shí)SIGIRR對巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA的表達(dá)也無影響(P>0.05)。
　　 (3)SIGIRR對SAP患者腹水刺激的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ含量的影響:
　　 ①SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量的影響:SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量均無影響(P>0.05)；同時(shí)SIG

14、IRR對巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量也無影響(P>0.05)。
　　 ②SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量的影響:未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞,經(jīng)SAP患者腹水作用后其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量均顯著低于對照組(P<0.05),而轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞其培養(yǎng)上清中IL-10含量兩組之間比較無顯著差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞其培養(yǎng)上清中IL-10含量顯著高

15、于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞(P<0.05),但對照組SIGIRR對巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量無影響(P>0.05)。
　　 ③SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量的影響:未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞,經(jīng)SAP患者腹水作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量均顯著高于對照組(P<0.05,P<0.001),而轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞其細(xì)胞培養(yǎng)上

16、清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量兩組之間比較無顯著差異(P>0.05)；無論是對照組還是實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-17和IFN-γ含量均顯著低于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞(P<0.05)。
　　 ④SAP患者腹水對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12含量的影響:無論是轉(zhuǎn)染還是未轉(zhuǎn)染SIGIRR的巨噬細(xì)胞,經(jīng)SAP患者腹水作用后其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12含量均顯著

17、高于對照組(P<0.05)；無論對照組還是實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的巨噬細(xì)胞其培養(yǎng)上清中IL-12含量顯著低于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的巨噬細(xì)胞(P<0.05,P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)SAP患者腹水可顯著抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)SIGIRR的表達(dá),上調(diào)TLR4和其下游分子MyD88、IRAK-1和TRAF-6的表達(dá),促進(jìn)促炎細(xì)胞因子分泌,這可能是SAP引起SIRS和MOF重要機(jī)制之一。
　　 (2)給予外源