YAP(yes-associateD-protein)在兔耳增生性瘢痕中表達(dá)的實驗研究.pdf

1、目的:Hippo信號通路是在果蠅身上發(fā)現(xiàn)控制器官大小的重要信號通路，yap蛋白是其中重要核心組件。組織器官對外界機(jī)械張力轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)分子效應(yīng)與Hippo信號通路密切相關(guān)。創(chuàng)面愈合及瘢痕形成涉及一系列復(fù)雜生物細(xì)胞學(xué)過程，增生性瘢痕的發(fā)生與多方面因素相關(guān)，如性別、年齡、體質(zhì)、感染等，病理上表現(xiàn)則是成纖維細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉淀，yap蛋白與成纖維細(xì)胞感受瘢痕壓力、增殖及生長因子的分泌密切相關(guān)。本實驗擬通過觀察兔耳創(chuàng)面愈合至增生性瘢痕形

2、成這一過程中yap蛋白的表達(dá)、分布及變化，探討yap蛋白在創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕增生中的作用，為瘢痕的形成提供分子水平的理論依據(jù)，為瘢痕治療提供新的思路方法及治療靶點。
　　方法:選取10只新西蘭大耳白兔（由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心中心提供），雌雄不限，體重平均2.5-3.0Kg。將每只兔子左耳設(shè)定為A組，右耳設(shè)定為B組，A組每只大耳兔用打孔器在左耳打3個直徑0.6cm圓形全層皮損至軟骨，并徹底破壞軟骨膜，熱凝止血;B組每只大耳兔耳用打孔器

3、打3個直徑1cm圓形全層皮損至軟骨,徹底破壞軟骨膜，熱凝止血，每個創(chuàng)面間隔＞1cm。其后，每只兔子飼養(yǎng)條件相同，7天后祛除痂殼。14天時取靠近頭部創(chuàng)面;30天時取兔耳中間創(chuàng)面;60天取剩下創(chuàng)面。將所取標(biāo)本置于10％中性福爾馬林中固定12小時，常規(guī)梯度酒精脫水，浸蠟包埋切片，做免疫組化組織學(xué)染色。Yap蛋白免疫組化染色陽性信號為棕黃色顆粒。yap圖像分析方法:1、在400倍顯微鏡下分別觀察各切片中表皮及表皮下細(xì)胞中yap陽性顆粒個數(shù)，并計

4、算。每張切片觀察5個視野取其均數(shù)進(jìn)行比較。2、用Image-pro6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，將yap的表達(dá)強(qiáng)度用IOD值表示，每張切片取5個視野，分別測定每個視野的IOD值并取其均數(shù)作為該標(biāo)本的IOD值，進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:一、新西蘭大耳白兔瘢痕造模成功率:A組造模出24個合格瘢痕，成功率為80％，B組造模出27個合格瘢痕，成功率為90％(模型成功標(biāo)準(zhǔn):肉眼可見明顯創(chuàng)面組織增生、質(zhì)硬，瘢痕表面較周圍正常組織高出2mm);二、顯微鏡

5、下yap免疫組化染色結(jié)果:1、14天時，A組及B組創(chuàng)面周圍組織向創(chuàng)面中心回縮，大部分創(chuàng)面干燥，顯微鏡下創(chuàng)面肉芽組織、炎性細(xì)胞及毛細(xì)血管增生，表皮細(xì)胞中yap蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中可見細(xì)小棕黃色顆粒，此期成纖維細(xì)胞數(shù)量少，棕黃色顆粒少數(shù)發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞核中;2、30天時，肉眼觀察，創(chuàng)面愈合且瘢痕增生明顯，增生瘢痕色紅、質(zhì)硬，瘢痕中心高于周圍皮面，B組較A組瘢痕增生明顯，纖維鏡下看，瘢痕表面為薄層表皮細(xì)胞并伴角化，正常皮膚附件如毛囊

6、、皮脂腺等缺乏，瘢痕下，部分成纖維細(xì)胞生成，呈梭形并排列整齊，棕黃色顆粒出現(xiàn)于成纖維細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)棕黃色淡染;3、60天時，肉眼觀察，A組部分模型瘢痕較30天縮小，其余個別瘢痕較30天垂直直徑增大，且硬度增加，顯微鏡下看，瘢痕表皮下大量成纖維細(xì)胞生成，成纖維細(xì)胞呈梭形并排列整齊，B組部分瘢痕成纖維細(xì)胞排列紊亂，漩渦狀排列形成，個別瘢痕可見玻璃樣變。4、70-90天觀察，肉眼見瘢痕縮小，纖維鏡下看，成纖維細(xì)胞減少，部分正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失玻璃

7、樣變。三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析:1、14天時，B組在陽性顆粒數(shù)、積分光密度、平均光密度數(shù)值上均高于A組，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;2、30天時，B組在在陽性顆粒數(shù)高于A組，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，積分光密度、平均光密度數(shù)值上均高于A組，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;3、60天時，B組在在陽性顆粒數(shù)高于A組，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，積分光密度、平均光密度數(shù)值上均高于A組，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

8、;4、陽性顆粒數(shù)A組第14天:22.38±5.12，第30天:34.88±3.56，第60天:32.38±5.82，30天與60天數(shù)值均高于14天，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，60天數(shù)值小于30天，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;B組第14天:35.13±6.12，第30天:39.63±5.68，第60天;34.50±2.4430天數(shù)值高于14天及60天，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，60天數(shù)值小于30天，P＞0.05，

9、差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;5、平均光密度A組第14天:0.20±0.01，第30天:0.24±0.03，第60天:0.22±0.06，30天數(shù)值大于14天，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，30天數(shù)值大于60天，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;B組第14天:0.22±0.01，第30天:0.30±0.04，第60天:0.31±0.02，30天大于14天，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，30天小于60天數(shù)值，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計

10、學(xué)意義;6、積分光密度A組第14天:1016.63±90.07，第30天:1368.00±169.01，第60天:1355.13±162.87，30天與60天數(shù)值均大于14天，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，30天數(shù)值大于60天，P＞0.05，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義;B組第14天:1358.38±186.57，第30天:1921.75±100.76，第60天:1911.88±114.00，30天與60天數(shù)值高于14天，P＜0.05，差