載siCTGF殼聚糖納米粒在兔耳增生性瘢痕中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　增生性瘢痕往往是皮膚在遭受創(chuàng)傷或重度燒傷后難以避免的愈合結(jié)果。瘢痕繼續(xù)發(fā)展還會(huì)導(dǎo)致皮膚瘙癢、活動(dòng)受限、外觀畸形以及攣縮等諸多問題，給患者生理和心理兩方面均造成不良影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有數(shù)百萬人遭受瘢痕帶來的身心傷害，生活質(zhì)量很差。由于傳統(tǒng)治療手段難以產(chǎn)生滿意的效果，因此迫切需要尋找一種新的治療方式來防治增生性瘢痕。
　　1991年Bradham等首先在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)人類CTGF。CTGF作為一類基

2、質(zhì)細(xì)胞蛋白，主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及損傷時(shí)表達(dá)相應(yīng)增加。CTGF病理生理功能主要是刺激細(xì)胞有絲分裂、粘附、凋亡、ECM合成分泌以及促進(jìn)其他類型細(xì)胞的遷移，同時(shí)它還能夠改變其他分子的活性。最近，越來越多文獻(xiàn)證實(shí)CTGF在病理性瘢痕真皮層中過量表達(dá)，但是其參與瘢痕形成的具體機(jī)制仍不十分清楚。
　　干擾(interference RNA) RNA是一種短雙鏈RNA，作為一種基因沉默技術(shù)，其可

3、以與mRNA互補(bǔ)配對(duì)并促使其降解，最終發(fā)揮特異性基因阻斷作用。siRNA作為RNAi技術(shù)的一種，相比反義核酸技術(shù)，具備基因抑制率高、特異性強(qiáng)以及濃度低等優(yōu)勢(shì)，在基因功能研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。然而，由于體內(nèi)外環(huán)境的復(fù)雜性，諸如核酸酶等酶類的存在，本身就不穩(wěn)定的裸siRNA在進(jìn)入細(xì)胞和胞核前極易被降解，因此總體轉(zhuǎn)染效率不高。之后雖然化學(xué)修飾或病毒載體等一些改進(jìn)措施可以延緩其降解，但又帶來細(xì)胞毒性大、效果差等缺點(diǎn)。因而，急需尋找一種更理想的

4、轉(zhuǎn)染載體來介導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮基因阻斷效應(yīng)。
　　殼聚糖是一種非病毒載體，具有細(xì)胞毒性低、免疫原性低、降解性好和生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)。此外，作為唯一一種天然陽離子材料，殼聚糖還可以與帶負(fù)電荷的核酸如DNA、siRNA以及miRNA等結(jié)合形成納米復(fù)合物。殼聚糖納米載體主要通過增進(jìn)與帶負(fù)電細(xì)胞膜的粘附和避免siRNA被內(nèi)源性核酸酶降解兩個(gè)方面來提高siRNA的基因干擾效率。近年來，殼聚糖納米粒作為一種安全、經(jīng)濟(jì)的非病毒載體，已

5、經(jīng)獲得了越來越多的關(guān)注。
　　基于以上背景，本研究通過將載siCTGF殼聚糖納米粒應(yīng)用于新愈合兔耳皮膚創(chuàng)面，通過靶向干擾CTGF的表達(dá)及其生物學(xué)功能，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞過度增殖、分化以及減少膠原蛋白合成沉積，最終發(fā)揮減輕瘢痕形成的作用。載siCTGF殼聚糖納米粒有望成為一種安全、有效的瘢痕防治技術(shù)。
　　第一部分構(gòu)建siCTGF以及篩選最佳干擾序列
　　研究目的:分離培養(yǎng)及鑒定原代瘢痕成纖維細(xì)胞;確認(rèn)構(gòu)建序列的有效性并

6、篩選最佳干擾序列。
　　研究方法:采用組織塊貼壁和胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法，分離培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定瘢痕成纖維細(xì)胞。參照siRNA設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用RNA在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)3段RNA干擾序列，分別轉(zhuǎn)染瘢痕成纖維細(xì)胞，并以無同源性的亂碼siRNA作為對(duì)照組，應(yīng)用RT-PCR、蛋白印跡等方法檢測(cè)各組細(xì)胞CTGF mRNA及蛋白的表達(dá)，比較分析后選出沉默效率最大的一組siCTGF。
　　研究結(jié)果:該改進(jìn)的方法能夠快速

7、分離出高活性的成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞儀得到FSP陽性率可達(dá)94.37±1.31％。該合成方法所構(gòu)建的siRNA能成功轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。與未轉(zhuǎn)染組和亂碼組相比，候選序列3的基因抑制效率最高，CTGFmRNA表達(dá)降低到0.294±0.093倍，CTGF蛋白表達(dá)降低到0.33±0.065倍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:干擾序列3的成纖維細(xì)胞CTGF基因沉默效率最高。
　　第二部分載siCTGF殼聚糖納米粒的制備及相

8、關(guān)特性的研究
　　研究目的:探討載siCTGF殼聚糖納米粒制備方法及其相關(guān)物理特征。
　　研究方法:采用經(jīng)改進(jìn)的離子膠凝法，通過對(duì)分子量、氮磷比等條件進(jìn)行摸索來制備載siCTGF殼聚糖納米粒。粒徑分析儀和透射電鏡分別檢測(cè)納米粒平均粒徑和電位，紫外分光光度計(jì)計(jì)算載藥率，同時(shí)對(duì)其在體外的控釋周期以及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，最后完成納米粒在細(xì)胞內(nèi)的示蹤。
　　研究結(jié)果:投射電鏡圖像顯示殼聚糖納米粒呈圓形顆粒，大小一致，分布均勻

9、，平均粒徑在98.3±2.7nm左右。粒徑分析儀測(cè)得zeta電位為15.3±4.2mV。siCTGF的包封率為96.5±2.4％。在PBS溶液中體外控釋周期最長(zhǎng)可達(dá)6天。CCK8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)提示空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，各濃度殼聚糖納米粒組未見明顯細(xì)胞毒性，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:本方法制備的殼聚糖納米粒具備粒徑小、細(xì)胞毒性低以及體外控釋周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是一種較好的基因轉(zhuǎn)染載體。
　　第三部分體外實(shí)驗(yàn)評(píng)

10、價(jià)載siCTGF殼聚糖納米粒對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的作用
　　研究目的:評(píng)價(jià)體外應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對(duì)成纖維細(xì)胞纖維化基因表達(dá)的抑制效果。
　　研究方法:實(shí)驗(yàn)按照空白對(duì)照組、載亂碼RNA殼聚糖納米粒組、三種濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組(50nmol/ml，100nmol/ml，200nmol/ml)分成5個(gè)組。選用CCK8試驗(yàn)方法比較各組對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖效率的影響;RT-PCR、Western-blot等技術(shù)測(cè)定

11、目標(biāo)基因CTGF、細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原以及細(xì)胞分化標(biāo)志α-SMA的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:CCK8法結(jié)果顯示相比空白組和陰性對(duì)照組，各濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組細(xì)胞增殖得到不同程度抑制，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。RT-PCR、Western-blot等技術(shù)測(cè)定目標(biāo)基因CTGF、細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原以及細(xì)胞分化標(biāo)志α-SMA表達(dá)，結(jié)果顯示載siCTGF殼聚糖納米粒組3種基因的表達(dá)水平均明顯低于空白組和陰性對(duì)照組(P＜

12、0.05)，又以200nmol/ml載siCTGF殼聚糖納米粒組下降程度最高。
　　研究結(jié)論:體外應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒能有效抑制成纖維細(xì)胞增殖，Ⅰ型膠原蛋白合成以及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　第四部分局部應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對(duì)兔耳瘢痕增生的影響
　　研究目的:評(píng)價(jià)局部應(yīng)用載siCTGF殼聚糖納米粒對(duì)瘢痕增生的抑制效果。
　　研究方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照空白對(duì)照組、載亂碼RNA殼聚糖納米粒組，三種濃度

13、載siCTGF殼聚糖納米粒組分成5組。采用活體成像儀監(jiān)測(cè)納米粒在裸鼠體內(nèi)的控釋周期;建立兔耳瘢痕模型，局部注射不同濃度載siCTGF殼聚糖納米粒，肉眼觀察局部創(chuàng)面瘢痕增生的大體圖像，并超聲探測(cè)儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療過程中瘢痕厚度的變化。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)局部真皮內(nèi)CTGF的表達(dá)分布，膠原合成（Ⅰ型膠原）以及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(α-SMA)的情況差異，并采用Masson三色染色法觀察真皮內(nèi)膠原的堆積及排列情況。同時(shí)，提取皮膚組織蛋白，采

14、用Western-blot技術(shù)檢測(cè)各組皮膚內(nèi)CTGF、Ⅰ型膠原、α-SMA三種蛋白的表達(dá)差異。
　　研究結(jié)果:納米粒組裸鼠創(chuàng)面可觀察到紅色熒光并持續(xù)到第5天。大體圖像可見第2周創(chuàng)面基本愈合，之后開始向外增生突起，到第6周增生達(dá)到頂峰，B型超聲結(jié)果顯示相比空白對(duì)照組和載亂碼RNA殼聚糖納米粒組，三種濃度載siCTGF殼聚糖納米粒組超聲測(cè)量值（瘢痕厚度）呈現(xiàn)不同程度下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。組織學(xué)結(jié)果顯示治療組真皮內(nèi)CTGF