益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織TRPC6、RhoA影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠模型腎組織中瞬時(shí)受體電位陽離子通道6(transientreceptorpotentialcanonical6,TRPC6)和RhoA(Ras homolog gene family,member A)表達(dá)的影響，同時(shí)觀察與降低蛋白尿及改善腎臟病理的相關(guān)性，進(jìn)而闡明益氣養(yǎng)陰活血方對(duì) DN作用機(jī)制，為臨床廣泛應(yīng)用該方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用鏈脲佐菌素(streptozotocin

2、,STZ)腹腔注射方法制備大鼠DM模型，選用0只清潔級(jí)雄性SD大鼠，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，禁食12h，隨機(jī)分成DN模型組(簡(jiǎn)稱模型組)、空白組、代文組、代文+中藥高劑量組(簡(jiǎn)稱中高組)、代文+中藥低劑量組(簡(jiǎn)稱中低組)各12只，模型各組按45mg/kg腹腔內(nèi)一次性注射STZ，空白組則注射等量的檸檬酸鈉緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)配，避光冰浴)。將全部模型大鼠放入相同環(huán)境條件的動(dòng)物房?jī)?nèi)，分入不同的籠內(nèi)飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食。每天觀察大鼠的一般狀況，連續(xù)

3、喂養(yǎng)72h后，監(jiān)測(cè)血糖、尿糖、尿蛋白、尿量，造模大鼠若血糖值＜16.7mmol/L、尿糖在++以下(含++)、尿蛋白陰性，尿量小于正常組150％，則給予剔除?？瞻捉M大鼠不予剔除。成模后，給予模型組和空白組0.9%生理鹽水按1ml/100g?d灌胃，代文組按1.67mg/200g?d灌胃，中高組和中低組則分別按照成人用藥劑量的12.5倍、6.25倍灌胃，連續(xù)灌胃6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天，用代謝籠收集24h尿液。處死大鼠時(shí)，腹主動(dòng)脈取血，隨后取

4、腎做病理檢測(cè)。觀察各組大鼠的一般狀況、肥大指數(shù)、24h尿蛋白定量、生化指標(biāo)(包括Scr、BUN、ALB、ALT、C、TG和FBG等)的變化，分別使用HE、PAS染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理變化，免疫組化法檢測(cè)腎臟組織中TRPC6和RhoA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.改善實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀況
　　空白組大鼠的一般狀況保持良好，而DN造模各組大鼠皮毛粗糙、沒有光澤，精神萎靡，易怒，自主活動(dòng)明顯減少，大便稀、不成形，飲食量

5、及尿量明顯增多，體重反而明顯減輕。通過藥物干預(yù)后，治療各組大鼠皮毛較模型組光澤，飲水量有所減少，其他狀況也有所改善。
　　2.對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟病理組織學(xué)的影響
　　肉眼觀察：空白組大鼠的腎臟形態(tài)正常，如蠶豆般大小，呈暗紅色，表面光，包膜無粘連、易剝離；模型組大鼠的腎臟體積較正常大鼠明顯增大，表面及質(zhì)略呈灰白色，髓質(zhì)顏色加深、與皮質(zhì)分界清楚，包膜有粘連。HE染色和PAS染色：光鏡下觀察到空白組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)完整，系膜基質(zhì)正常，

6、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠腎組織則腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增多，毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚，腎間質(zhì)小管出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞有空泡變性,腎小球基質(zhì)內(nèi)與毛細(xì)血管內(nèi)皮下有糖原貯積。治療各組大鼠腎組織腎小球體積較模型組不同程度減小，毛細(xì)血管基底膜彌漫性增厚、基質(zhì)增多程度減輕。
　　3.各組大鼠間體重、腎重、肥大指數(shù)（腎重/體重）的比較
　　大鼠體重在空白組與造模各組間的差異非常明顯,而腎重

7、無顯著性差異。肥大指數(shù)的比較如下：空白組與造模各組之間存在顯著性差異（P<0.01）；模型組與治療各組差異顯著（P<0.01）；代文組與中高、低組之間的差異顯著（P<0.01）；中高、低組之間也存在顯著性差異（P<0.01）。
　　4.對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠生化指標(biāo)的影響
　　各組大鼠ALT、BUN、Scr的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ALB比較：空白組與造模各組具有顯著性差異（P<0.01）；代文組（18.28±0.90）與模型

8、組（16.99±0.69）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與中高組（21.80±1.16）、中低組（20.81±0.99）的差異顯著（P<0.01）；中高、低組之間則無顯著性差異（P>0.05）。TC比較：空白組（1.39±0.26）與代文組、模型組、中低組相比，差異顯著（P<0.01），而與中高組（1.62±0.09）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；代文組（2.08±0.20）與模型組（2.09±0.22）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0

9、.05），而與中高組(1.62±0.09)、中低組(1.84±0.10)差異顯著（P<0.01）。TG比較：空白組（1.12±0.38）與造模各組有顯著性差異（P<0.01或P<0.05）；代文組（3.32±0.37）與模型組（3.60±0.68）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與中高組(1.35±0.14)、中低組(1.64±0.44)差異顯著（P<0.01）。血糖比較：空白組與造模各組相比較（P<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型

10、組與治療各組相比（P<0.05或P<0.01），代文組與中藥組相比，差異顯著（P<0.01）；中高、低組之間的差異不明顯（P>0.05）。
　　5.各組大鼠間24h尿蛋白定量的對(duì)比
　　空白組大鼠的24h尿蛋白定量（0.0371±0.0166）與中高組（0.0553±0.0075）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與其他造模組（代文組、模型組、中低組）的差異顯著（P<0.01）；代文組（0.0834±0.0167）與中低組（

11、0.0802±0.0121）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與中高組差異顯著（P<0.01）。
　　6.各組大鼠腎組織中TRPC6和RhoA的表達(dá)情況
　　TRPC6在足細(xì)胞胞膜表達(dá)，RhoA表達(dá)主要分布于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)。與空白組比較，造模各組TRPC6和RhoA的表達(dá)量明顯增加，具有顯著性差異（P<0.01）；模型組TRPC6和RhoA的表達(dá)量最多，與治療各組的差異顯著（P<0.01）；代文組與中高、低組比較