DEPDC7基因在肝癌細胞中的功能學及其啟動子的實驗研究.pdf

1、目的：
　　功能未知基因DEPDC7是從基因芯片數(shù)據(jù)挖掘得到，DEPDC7基因在肝癌細胞內(nèi)參與的生命活動及其分子機制鮮有報道。本研究通過探討DEPDC7基因?qū)Ω伟┘毎脑鲋场⒖寺⌒纬珊颓忠u遷移能力的影響，并初步鑒定了DEPDC7基因的核心啟動子區(qū)域，為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制等指明方向。
　　方法：
　　(1)提取肝癌細胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1和SMMC-7721以及正常肝細胞L-02的DEPDC7 R

2、NA和蛋白，通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7基因在mRNA和蛋白水平上的表達差異。
　　(2)構(gòu)建過表達重組載體 pLV-DEPDC7和沉默重組載體pLV-DEPDC7-shRNA，通過慢病毒包裝并感染細胞的方法，獲得DEPDC7過表達細胞株和沉默細胞株，并通過 Real-Time PCR和Western blot方法檢測DEPDC7的表達情況。
　　(3)利用MTT法和平板克隆法

3、檢測各實驗組細胞的增殖能力和克隆形成能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，Transwell小室檢測細胞的侵襲遷移能力。
　　(4)利用生物信息學方法對人 DEPDC7基因的啟動子區(qū)域進行分析和預測，通過PCR法擴增DEPDC7基因近端啟動子序列，構(gòu)建一系列的啟動子區(qū)域熒光素酶報告基因載體，隨后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)并檢測各缺失片段螢光素酶活性。
　　結(jié)果：
　　(1)與正常肝細胞L-02比較，DEPDC7的mRNA和蛋白水

4、平在四株肝癌細胞中均是低表達。
　　(2)成功建立 DEPDC7基因過表達肝癌細胞系 Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7，蛋白表達顯著提高。成功建立DEPDC7基因沉默肝癌細胞系HepG2-RNAi，mRNA和蛋白水平均顯著降低。
　　(3)與對照組細胞相比，DEPDC7基因表達上調(diào)可以將 Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7的細胞周期阻滯在G0/G1期。相應的，細胞增殖能力、克隆形成能

5、力和侵襲遷移能力明顯下降。
　　(4)與對照組細胞相比，DEPDC7基因表達下調(diào)可以將HepG2-RNAi的細胞周期促使從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。相應的，細胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯增加。
　　(5)人 DEPDC7基因位于11p13。成功構(gòu)建不同長度缺失片段的啟動子重組質(zhì)粒。經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，所有的重組質(zhì)粒均表現(xiàn)出熒光素酶活性，其中DEPDC7P-3活性最強。
　　結(jié)論：<

6、br>　　(1)本研究首次探討了DEPDC7基因在肝癌細胞發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。DEPDC7基因過表達可以明顯抑制肝癌細胞生長增殖，干擾DEPDC7基因則可以明顯提高肝癌細胞增殖能力。推測DEPDC7基因參與細胞周期調(diào)控，通過調(diào)節(jié)細胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變進而調(diào)節(jié)細胞增殖能力的改變。
　　(2)DEPDC7基因過表達可以明顯抑制肝癌細胞侵襲遷移，相反干擾DEPDC7基因則可以明顯促進肝癌細胞侵襲遷移。推測 DEPDC7基