人肺癌細(xì)胞中microRNA let-7a-1-7f-1啟動子的克隆及其功能的初步分析.pdf

1、一、研究背景
　　 microRNAs(miRNA)是一類廣泛存在于多種生物體的非編碼小RNA，其長度通常為22bp左右。microRNAs分子可通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或不完全的配對來降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達。通過對靶基因的負(fù)向調(diào)控，microRNA參與調(diào)節(jié)著多種生物學(xué)過程，如早期發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡等，而miRNA的異常則與多種疾病和腫瘤相關(guān)。目前研究發(fā)

2、現(xiàn)約50％已得到注解的microRNAs在人類基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點;某些組織特異性microRNA基因表達圖譜的改變可見于乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、肺癌、垂體瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤組織中，提示表明miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前認(rèn)為，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展既可作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，也可作為癌基因下調(diào)抑癌基因的活性。因此研究miRNA在腫瘤中的作用有助于全面而深入地探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，并可為

3、腫瘤的臨床診斷與治療提供新靶點。
　　 let-7家族是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，在成人組織中廣泛表達（has-let-7），以肺組織的表達豐度最高。Takamizawa等發(fā)現(xiàn)肺癌患者的let-7表達水平顯著降低，并且let-7表達水平低的患者經(jīng)手術(shù)切除治療后，預(yù)后較差。體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，在人肺癌細(xì)胞中高表達let-7則可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。這說明let-7是具有抑癌作用的miRNA，與肺癌高度相關(guān)，有望成為肺癌分子靶向治

4、療的一個新靶點。
　　 目前對let-7在肺癌組織細(xì)胞中低表達的機制尚缺乏全面信息，而Takamizawa及Yanaihara等研究者通過實時定量PCR(qRT-PCR)檢測到在肺癌組織細(xì)胞中pri-hsa-let-7表達水平下降，提示轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控異常至少是hsa-let-7低表達的部分原因。但目前對hsa-let-7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制仍知之甚少。本課題選取let-7家族中含量最豐富，且成簇位于9q22.32的let-7a-1和l

5、et-7f-1作為切入點，對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行初步研究。
　　 二、研究目的
　　 鑒定miRNA簇let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點，克隆其啟動子，并對let-7a-1/7f-1啟動子的功能進行初步分析，為探討let-7a-1/7f-1在肺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。
　　 三、實驗方法
　　 首先通過5'RACE確定let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點，繼而通過PCR擴增let-7a-1/7

6、f-1基因5’上游2123bp的啟動調(diào)控區(qū)片段(-1999bp/+124bp)，插入熒光素酶報道基因質(zhì)粒pGL3-Basic，構(gòu)建let-7a-1/7f-1啟動子-熒光素酶報道基因質(zhì)粒pGL3-2123，瞬時轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549，檢測其啟動子活性。然后對pGL3-2123的啟動子功能進行初步分析。pGL3-2123瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，分別經(jīng)過9-順維甲酸(9cRA)、全反式維甲酸(AT-RA)、地塞米松(DEX)或1，25-(OH)2

7、D3處理48h或?qū)GL3-2123分別與真核表達載體pCMV-p53，pcDNA3.1(+)-Sp1，pcDNA3.1(+)-NFκBp50,pcDNA3.1(+)-PPARγ2,pcDNA3.1(+)-c/EBPα,pBABEpuro-ras或pBABEhygro-myc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h，收取細(xì)胞，進行雙熒光素酶活性的檢測，觀察它們對A549細(xì)胞中l(wèi)et-7a-1/7f-1啟動子活性的影響。
　　 四、實驗結(jié)果

8、>　　 通過5'RACE，確定了let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點;PCR擴增的let-7a-1/7f-1基因5’上游2123bp啟動子片段與熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建成的融合質(zhì)粒(pGL3-2123)經(jīng)酶切電泳及測序鑒定正確;pGL3-2123質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，雙熒光素酶活性測定M1/M2為5.24，而pGL3-control和pGL3-basic的相對熒光素酶活性M1/M2分別為38.76和0.26。DEX能夠增強1

9、et-7a-1/7f-1啟動子的活性，但ATRA，9cRA，1，25-(OH)2D3對let-7a-1/7f-1啟動子的活性沒有產(chǎn)生明顯影響。腫瘤相關(guān)因子c/EBPα和p53的真核表達載體與pGL3-2123共轉(zhuǎn)染時，能夠增強let-7a-1/7f-1的啟動子活性;而共轉(zhuǎn)染的PPARγ2，NF-KappaB，Sp1，ras和myc的真核表達載體對let-7a-1/7f-1啟動子的活性沒有明顯影響。
　　 五、實驗結(jié)論
　　

10、 成功鑒定了microRNA簇let-7a-1/7f-1的轉(zhuǎn)錄起始點，構(gòu)建了2.1kb的let-7a-1/7f-1啟動調(diào)控區(qū)-熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-2123;該質(zhì)粒經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染和報告基因分析，檢測到了明顯但相對于陽性對照較低的啟動子活性，這與let-7a-1/7f-1在肺癌A549細(xì)胞中發(fā)生了表達下調(diào)相一致。腫瘤相關(guān)因子c/EBPα和p53以及糖皮質(zhì)類激素藥物地塞米松(DEX)能夠增強肺癌細(xì)胞中該啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。這一研究結(jié)果為