肝細(xì)胞癌中DEK基因啟動(dòng)子甲基化研究.pdf

1、目的:DEK蛋白最初被發(fā)現(xiàn)于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中，它與CAN形成DEK-CAN融合蛋白。DEK在多種腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，顯現(xiàn)出與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系。DEK基因在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞，提示DEK可能在HCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。我們希望通過(guò)研究DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域在HCC細(xì)胞系中的甲基化水平與DEK表達(dá)量之

2、間的關(guān)系來(lái)闡明DEK基因在HCC中表達(dá)上調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　方法:選取七種HCC細(xì)胞系，以一種正常肝細(xì)胞系和一例正常肝組織作為對(duì)照，通過(guò)熒光定量PCR和Western blotting方法，分別檢測(cè)DEK在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量。應(yīng)用亞硫酸氫鈉-基因組測(cè)序法(Bisulfite genome-sequencing，BGS)測(cè)定DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，并獲得了詳細(xì)的甲基化位點(diǎn)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)DEK啟動(dòng)子

3、區(qū)域進(jìn)行分析，確定其可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用PCR法擴(kuò)增了位于DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域的4個(gè)片段，分別將用甲基化酶處理過(guò)和未處理過(guò)的各片段插入熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)活性。
　　結(jié)果:DEK mRNA和蛋白表達(dá)水平在HCC細(xì)胞中均上調(diào)。BGS法檢測(cè)結(jié)果顯示，DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化水平在HCC細(xì)胞系中明顯下調(diào)，正常肝細(xì)胞和正常肝組織的DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平較高，并且集

4、中在啟動(dòng)子下游，緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域。通過(guò)分析DEK基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島上的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)許多甲基化的位點(diǎn)恰好位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列上。熒光素酶表達(dá)活性檢測(cè)結(jié)果顯示，甲基化能夠普遍抑制DEK啟動(dòng)子的活性;在未被甲基化處理的片段中，CpG島的近轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(CpG2-1)活性明顯高于其上游啟動(dòng)子片段(CpGl)活性，而CpG2-1片段中只保留集中發(fā)生甲基化的緊鄰轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(CpG2-2)啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯降低。
　　結(jié)論:HCC中D