玉米微管結(jié)合蛋白ZmMAP65-1a和轉(zhuǎn)錄因子ZmNAC在非生物脅迫中的功能研究.pdf

1、干旱、高鹽和低溫是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育和限制作物產(chǎn)量提高的主要非生物脅迫因素。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)植物應(yīng)答非生物脅迫與微管的動(dòng)態(tài)變化有著密切的聯(lián)系。微管的這種動(dòng)態(tài)變化需要微管結(jié)合蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)的精確調(diào)控，MAP65就是其中一種非常重要的微管結(jié)合蛋白。
　　運(yùn)用RT-PCR技術(shù)在玉米幼苗葉片中克隆出1個(gè)玉米微管結(jié)合蛋白ZmMAP65-1a。進(jìn)化樹(shù)分析表明，ZmMAP65-1

2、a與水稻MAP65-1高度同源，編碼產(chǎn)物為584個(gè)氨基酸，分子量為65.18kD，等電點(diǎn)為4.845。結(jié)構(gòu)分析表明ZmMAP65-1a微管結(jié)合區(qū)MTB2存在著磷酸化位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明ZmMAP65-1a可能定位在微管上。
　　首先利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)和瞬時(shí)沉默體系研究表明ZmMAP65-1a參與了BR誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)。瞬時(shí)表達(dá)mMAP65-1a能顯著提高抗氧化防護(hù)酶SOD和APX的基因表達(dá)和酶活性，而瞬時(shí)沉默mMAP65

3、-1a則出現(xiàn)相反的結(jié)果。進(jìn)一步利用原生質(zhì)體瞬時(shí)沉默體系研究表明，ZmMAP65-1a通過(guò)調(diào)節(jié)NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的表達(dá)參與了BR誘導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體中H2O2的產(chǎn)生。其次利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)體內(nèi)證明了ZmMAP65-1a與ZmMPK5互作，體外磷酸化實(shí)驗(yàn)表明ZmMPK5直接磷酸化ZmMAP65-1a。并且進(jìn)一步證明了ZmMAP65-1a與ZmMPK5在BR誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中存在相關(guān)性，這些結(jié)果表明ZmMPK

4、5參與BR誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)的一條途徑是通過(guò)磷酸化ZmMAP65-1a完成的。
　　已有證據(jù)顯示，BR處理可以誘導(dǎo)玉米葉片ABA的積累。利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)和瞬時(shí)沉默體系研究表明ZmMAP65-1a參與了ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)。ABA合成抑制劑實(shí)驗(yàn)表明ABA參與了BR對(duì)ZmMAP65-1a、ZmrbohA-D基因表達(dá)和ZmMPK5激酶活性的上調(diào)作用。這些結(jié)果表明ZmMAP65-1a與ZmMPK5參與BR誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)是通過(guò)BR誘導(dǎo)

5、ABA產(chǎn)生進(jìn)而將信號(hào)傳遞下去。
　　NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它的命名來(lái)源于牽牛花NAM、擬南芥ATAF1/2和CUC2基因的首個(gè)字母。作為一類龐大的基因家族，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的很多生理進(jìn)程包括發(fā)育、衰老、次生壁建成、應(yīng)答生物和非生物脅迫。本實(shí)驗(yàn)利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)、瞬時(shí)沉默和顯性嵌合抑制沉默體系分析ZmNAC在ABA依賴的脅迫信號(hào)途徑中的作用，并進(jìn)一步研究其與ZmCCaMK互作在抗氧化防護(hù)中的作用，同時(shí)

6、構(gòu)建了過(guò)表達(dá)ZmNAC的轉(zhuǎn)基因煙草初步探索了其在逆境脅迫中的初步功能。
　　運(yùn)用生物信息學(xué)詳細(xì)分析ZmNAC的結(jié)構(gòu)特性，Zm NAC編碼431個(gè)氨基酸，分子量為47.94kD，等電點(diǎn)為7.74，具有一個(gè)保守的N端NAM結(jié)構(gòu)域，位于43aa-204aa。亞細(xì)胞定位顯示其位于細(xì)胞核，酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且C端為其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)表明ZmNAC可以與玉米ZmERD1基因啟動(dòng)子的順式作用元件CATG

7、TG結(jié)合。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZmNAC在玉米各種組織中組成型表達(dá)，與其他組織相比在雌花中表達(dá)量最高，并且響應(yīng)各種非生物脅迫和外源激素處理。
　　首先利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)、瞬時(shí)沉默和顯性嵌合抑制沉默體系研究表明ZmNAC參與ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ZmNAC通過(guò)調(diào)節(jié)玉米NADPH氧化酶基因ZmrbohA-D的基因表達(dá)參與調(diào)節(jié)ABA誘導(dǎo)的H2O2的產(chǎn)生。ABA合成抑制劑實(shí)驗(yàn)表明ZmNAC響應(yīng)NaCl、PEG的

8、脅迫信號(hào)依賴于或部分依賴于ABA。利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)體內(nèi)證明了ZmCCaMK與ZmNAC互作，并且證明了ZmCCaMK與ZmNAC在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中存在相關(guān)性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ZmCCaMK與ZmNAC的相互作用同樣影響玉米原生質(zhì)體H2O2的產(chǎn)生。體外磷酸化實(shí)驗(yàn)表明ZmCCaMK可以直接磷酸化ZmNAC，并利用點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)找到了影響ABA誘導(dǎo)的SOD和APX酶活性ZmNAC可能的磷酸化位點(diǎn)。另外本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ZmNAC