非生物脅迫下棉花植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)轉(zhuǎn)錄因子的研究.pdf

1、目的:通過(guò)對(duì)陸地棉(GossypiumhirsutumL.)PHD(planthomeodomain)轉(zhuǎn)錄因子在棉花不同組織和非生物脅迫條件下的表達(dá)分析,篩選并克隆棉花逆境脅迫應(yīng)答基因,初步探究棉花植物同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子在非生物下的應(yīng)答模式以及轉(zhuǎn)基因模式植物抗逆性能。
　　方法:根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息,合成了28個(gè)棉花GhPHD基因的EST序列的特異引物,使用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了GhPHD在棉花種子、根、莖、葉

2、、纖維(15DPA)中的表達(dá)以及在干旱、高鹽(150mmol.L-1NaCl)、低溫(4℃)非生物脅迫下的表達(dá)模式。使用RACE技術(shù)擴(kuò)增了GhPHD1的5’和3’末端拼接得到了該基因的全長(zhǎng)cDNA。利用基因克隆技術(shù)克隆了GhPHD6和GhPHD9,連接植物表達(dá)載體,利用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,獲得轉(zhuǎn)基因煙草,利用葉綠素?zé)晒鈨x光合儀等測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草最大光合產(chǎn)量,光和速率,脯氨酸等的生理指標(biāo)。
　　結(jié)果:GhPHDs基因的組織表達(dá)分析表明,

3、85.7％的PHD基因在種子中表達(dá),在根、莖、葉、纖維中依次為57.1%、53.6%、46.4%、35.7%。半定量RT-PCR分析表明,有17個(gè)GhPHDs至少響應(yīng)1種非生物脅迫,其中GhPHD1對(duì)干旱、高鹽和低溫均有應(yīng)答,GhPHD1、GhPHD10、GhPHD15、GhPHD16、GhPHD22、GhPHD25等6個(gè)基因參與干旱和高鹽應(yīng)答,GhPHD1、GhPHD8、GhPHD9等7個(gè)基因響應(yīng)冷脅迫。RACE擴(kuò)增了GhPHD1的5

4、’端和3’末端,經(jīng)過(guò)測(cè)序得到5’擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為388bp,3’擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為425bp。拼接得到了1396bp的cDNA全長(zhǎng)序列。GhPHD1最大ORF為978bp克隆得到了GhPHD1的全長(zhǎng)序列?？寺〔@得了GhPHD6和GhPHD9的轉(zhuǎn)基因煙草。在13%的PEG6000模擬干旱的條件下,GhPHD6轉(zhuǎn)基因煙草的最大光合產(chǎn)量,胞間二氧化碳濃度,氣孔導(dǎo)度,脯氨酸含量和丙二醛的含量都顯著的高于對(duì)照野生型煙草,但是,電導(dǎo)率低于野生型。在4℃

5、低溫處理下,GhPHD9轉(zhuǎn)基因煙草的最大光合產(chǎn)量,胞間二氧化碳濃度,氣孔導(dǎo)度,脯氨酸,丙二醛,電導(dǎo)率的趨勢(shì)與野生型煙草相似,無(wú)明顯的差異。
　　結(jié)論:GhPHDs在陸地棉不同器官和組織中存在差異表達(dá)。在種子中GhPHDs的表達(dá)最多(85.7%),纖維中表達(dá)最少(35.7%)。在非生物脅迫下,28個(gè)GhPHDs基因的表達(dá)模式不盡相同。多個(gè)基因參與2種以上脅迫處理,表明GhPHDs在陸地棉適應(yīng)逆境脅迫中具有不同或相似的功能。RACE擴(kuò)