玉米SKIP同源基因ZmSKIP的克隆及在非生物脅迫中的功能分析.pdf

1、在農(nóng)作物的栽培中，非生物脅迫是限制植物生長(zhǎng)及產(chǎn)量的主要因子。玉米是集糧食、飼料和工業(yè)原料于一體的我國(guó)第二大糧食作物，在國(guó)家糧食安全及國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有舉足輕重的地位。干旱缺水、土壤鹽漬化等非生物脅迫已經(jīng)成為我國(guó)許多地區(qū)玉米生產(chǎn)的主要限制因素，直接影響著玉米的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。傳統(tǒng)的抗逆育種存在著周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的不足，而利用基因工程技術(shù)可以將抗逆基因?qū)胫仓晏岣咧参飳?duì)非生物脅迫的抗性已經(jīng)具有廣泛的應(yīng)用。因此發(fā)掘玉米中抗非生物脅迫的基因并利用基

2、因工程改造玉米是提高玉米在非生物脅迫下穩(wěn)產(chǎn)或減產(chǎn)少的有效途徑。
　　近年來(lái)，已有報(bào)道前體mRNA（pre-mRNA）剪切因子能夠響應(yīng)非生物脅迫并提高非生物脅迫的抗性。在本研究中，我們?cè)谟衩字锌寺×艘粋€(gè)pre-mRNA剪切因子SKIP同源的基因ZmSKIP，并且研究了它在逆境中的功能，為玉米抗逆基因工程育種提供重要的參考。主要結(jié)果如下：
　　1、ZmSKIP編碼一個(gè)含有609個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示 Zm

3、SKIP具有SNW/SKIP蛋白特有保守的S-N-W-K-N序列，與水稻中的SKIP基因同源性高達(dá)85％。ZmSKIP具有一個(gè)核定位序列。根據(jù)其核酸序列分析，在玉米基因組中，SKIP基因只有一個(gè)拷貝。通過(guò)生物信息學(xué)分析，ZmSKIP是SNW/SKIP共剪切基因的同源蛋白。
　　2、ZmSKIP轉(zhuǎn)錄受干旱、高鹽、ABA（Abscisic Acid）的誘導(dǎo)。在ZmSKIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草中，GUS染色表明GUS在測(cè)

4、試的各組織中都有表達(dá)，尤其在幼嫩的葉片中表達(dá)強(qiáng)烈。GUS酶活性熒光測(cè)定結(jié)果表明在NaCl、甘露醇、PEG（Polyethylene Glycol）和ABA的處理?xiàng)l件下表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　3、為了證實(shí)ZmSKIP蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了CaMV35S：ZmSKIP：：GFP融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微觀察結(jié)果顯示 ZmSKIP定位于細(xì)胞核。
　　4、為進(jìn)一步確定ZmSKIP基因的功能，構(gòu)建了CaMV35S啟

5、動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ZmSKIP的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。在含有300 mM甘露醇、200 mM NaCl和0.1 mM ABA的MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因煙草的根生長(zhǎng)受到的抑制較少。在干旱、高鹽和ABA處理?xiàng)l件下，土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了明顯的抗性。
　　5、在逆境處理?xiàng)l件下測(cè)定了超表達(dá) ZmSKIP轉(zhuǎn)基因煙草 T1代植株和野生型煙草植株的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶(Catalase

6、，CAT）、過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD）的活性和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以及相對(duì)電導(dǎo)率(Relative Electrical Conductivity，REC)。結(jié)果表明，在干旱、甘露醇、NaCl和ABA處理?xiàng)l件下，相對(duì)于野生型煙草，轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較高的抗氧化酶活性和較低的相對(duì)電導(dǎo)率（傷害率）和MDA含量。
　　6、采用熒光定量PCR方法測(cè)試了在甘露醇、NaCl和ABA處理12小時(shí)的植

7、株中的逆境相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果也顯示，相對(duì)于正常條件下生長(zhǎng)的煙草，超表達(dá)ZmSKIP轉(zhuǎn)基因植株在甘露醇、NaCl和ABA處理12小時(shí)條件下，CAT基因表達(dá)均明顯上調(diào)。對(duì)于APX基因，轉(zhuǎn)基因煙草在處理后都有上調(diào)，而野生型煙草則是下調(diào)。對(duì)于PR5基因，野生型煙草在處理后出現(xiàn)下調(diào)，轉(zhuǎn)基因煙草在甘露醇處理?xiàng)l件下有明顯上調(diào)。
　　7、在外源水楊酸(Salicylic Acid，SA)處理?xiàng)l件下，GUS酶活熒光定量分析以及生理生化指標(biāo)和植物