RT-PCR技術(shù)檢測貝類中諾瓦克樣病毒的研究.pdf

1、諾瓦克樣病毒是引起非菌性急性胃腸炎的重要病原之一，國內(nèi)外由諾瓦克樣病毒引發(fā)的食物中毒屢屢發(fā)生。引起食物中毒的食品多為貝類、蔬菜、沙拉、熟食等。本研究針對食品中(貝類)諾瓦克樣病毒RT-PCR檢測的特殊性，建立了快速檢測貝類中諾瓦克樣病毒的RT-PCR方法，消除RT-PCR反應(yīng)抑制因子，縮短食品中諾瓦克樣病毒的檢測時間，提高檢測方法的靈敏性，為諾瓦克樣病毒引起的食源性疾病的快速診斷提供技術(shù)支持。 本研究以諾瓦克樣病毒的依賴RNA的

2、RNA聚合酶區(qū)為靶基因，選擇特異性引物，進行RT-PCR擴增，檢測貝類中的諾瓦克樣病毒。對PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、引物量、退火溫度和循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，以確定適宜RT-PCR反應(yīng)體系和RT-PCR擴增程序，其適宜反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系為20μL。包括AMV(5U·μL-1)1μL，5×Reversetranscriptasebuffer4μL,RNaseInhibitor(40U·μL-1)0.5μL，dNTPs混合物(

3、10mmol·L-1each)2μL，下游引物(10μmol·L-1)3.5μL，模板4μL，水5μL；PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系為50μL。包括RT-Mixture20μL，10×PCRbuffer5μL，Taq(5U·μL-1)1μL，dNTPs混合物(2.5mmol·L-1each)5μL，上游引物(10μmol·L-1)2μL，Mg2+(25mmol·L-1)7μL，水10μL。其適宜RT-PCR擴增程序為：反轉(zhuǎn)錄過程為42℃，

4、1h;PCR反應(yīng)過程為，94℃預(yù)變性3min；變性94℃0.5min,退火46.9℃1.5min，延伸72℃1.0min，進行40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2﹪的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對RT-PCR擴增產(chǎn)物進行了DNA測序，RT-PCR擴增產(chǎn)物DNA序列與靶基因序列的同源性達99﹪，從而證實RT-PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物。RT-PCR方法的檢測靈敏度為79RT-PCR50。 本研

5、究對富集貝類中諾瓦克樣病毒的4種方法進行了比較，確定了一種可有效從貝類中濃縮諾瓦克樣病毒的方法。該方法對貝類中的病毒粒子可選擇沉淀，能較大程度的去除貝類樣品中含有的RT-PCR反應(yīng)抑制因子。同時對4種諾瓦克樣病毒RNA的提取方法進行了比較，確定了一種有效的RNA提取方法。該方法能提取完整且純度較高的諾瓦克樣病毒RNA，提高了反應(yīng)的靈敏度。貝類中該病毒的檢出限為8.1×102RT-PCR50/5g貝肉，可在11h內(nèi)完成對貝類中諾瓦克樣病毒