過氧化物酶增殖物激活受體γ抑制大鼠肝星狀細胞生長和轉化生長因子-β1誘導的結締組織生長因子表達.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝損傷因素如病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酗酒等所致的可逆的共同病理改變，并最終導致晚期不可逆性肝硬化發(fā)生。如何早期阻止并逆轉肝纖維化已成為基礎和臨床學科所共同關注的問題。其中，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)亦稱肝竇貯脂細胞或Ito細胞，其增殖活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵事件。在肝損傷過程中，HSC活化并轉化為成纖維樣細胞，表現為細胞大量增殖、失去維生素A貯存能力、表達α-平滑肌肌動蛋

2、白并過量產生、沉積細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，抑制HSC增殖活化成為逆轉肝纖維化治療的有效策略。 多種細胞因子和生長因子如轉化生長因子-β1(transforming growth factorbeta，TGF-β1)可通過刺激HSC活化并誘導其過量產生新膠原而促進肝纖維化進程。TGF-β1是損傷修復過程中結締組織生成的強力刺激信號，但其促膠原生成作用是間接通過結締組織生長因子(connect

3、ive tissue growth factor，CTGF)介導。CTGF是一種分子量為38 kD的C末端富含半胱氨酸的分泌多肽，屬于即刻早期基因CCN家族成員之一，在細胞增殖、遷移和細胞外基質的產生、沉積過程中作用廣泛。TGF-β1是肝纖維化過程中始發(fā)的致纖維化因子，而CTGF系由TGF-β1直接誘導HSC生成并被認為是TGF-β1致纖維化生物學作用的下游效應分子，因而阻斷TGF-β1-CTGF信號途徑可能成為肝纖維逆轉治療的有效方法

4、。過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator．activated receptor,PPAR)是配體活化的核轉錄因子，屬于核激素受體超家族，包括αβ/δ和γ三種亞型，在細胞增殖和分化過程中起重要作用。近年來研究證實，PPARγ在內皮細胞、血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞、HSC等多種細胞中廣泛存在。PPAR7與其配體結合并活化后，繼而與維甲酸X受體(retinoid X receptor α，RXRa)形成PP

5、ARγ-RXRα異源二聚體，該復合體可與靶基因啟動子上游的PPAR反應元件(peroxisome proliferating response element，PPRE)結合從而調控靶基因表達。既往的體內或體外實驗已證明，PPARγ活性降低與HSC纖維母細胞樣活化關系密切，而給予活化的HSC多種內源或外源性PPAR7配體可顯著抑制HSC纖維生成活性。但此種抑制效應是否真正由PPARγ所介導還不確定，因為PPARγ配體尚具有PPARγ非依

6、賴性生物學作用，且其具體作用機制亦不明確。 根據既往研究成果，我們推測PPARγ活化可能成為肝損傷過程中對抗肝纖維化的保護措施，而PPARγ活化最終抑制HSC生長并下調CTGF表達可能是其作用機制之一。為了驗證此假說，本實驗中我們觀察了PPARγ配體對大鼠HSC生長及TGF-β1誘導的CTGF表達的作用情況。 第一部分過氧化物酶增殖物激活受體γ對大鼠肝星狀細胞增殖與凋亡的影響。 目的： 探討過氧化物酶增殖

7、物激活受體γ(PPARγ)對大鼠肝星狀細胞(HSC)增殖與凋亡的影響。 方法： 常規(guī)培養(yǎng)大鼠HSC，經系列濃度的PPARy天然配體(15-d-PGJ<,2>)或合成配體(GW7845)作用后，通過噻唑藍(MTT)比色法及流式細胞儀觀察細胞的增殖和凋亡狀態(tài)，應用半定量RT-PCR和Western-blotting探討PPARγ配體誘導凋亡的分子機制，透射電鏡觀察HSC形態(tài)學變化。結果： 15-d-PGJ<,2>和G

8、W7845可通過抑制細胞增殖同時誘導凋亡而抑制HSC生長，且呈劑量依賴效應(各實驗組與對照組相比，P<0．01)；PPARγ活化可顯著抑制HSC中Bel-2基因表達(同時在轉錄和轉錄后水平)，且此抑制作用可被PPARγ特異性拮抗劑GW9662部分或完全逆轉，說明此種抑制效應確由PPARγ所介導；電鏡觀察亦顯示明顯的細胞凋亡發(fā)生。 結論： PPARγ活化可顯著抑制HSC增殖，并通過下調Bel-2基因表達而誘導凋亡，提示PP

9、ARγ可作為逆轉肝纖維化治療的新的有效靶點。 第二部分過氧化物酶增殖物激活受體丫對大鼠肝星狀細胞中轉化生長因子-β1誘導的結締組織生長因子表達的影響。 目的： 探討過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARy)對大鼠肝星狀細胞(HSC)中轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的結締組織生長因子(CTGF)表達的抑制作用。 方法： 常規(guī)培養(yǎng)大鼠HSC，預先給予或不給予PPARγ特異性拮抗劑GW9662處理

10、，再經系列濃度的PPARγ天然配體(15-d-PGJ<,2>)或合成配體(GW7845)及TGF-β1序貫作用后，通過半定量RT-PCR及Western-blotting分析CTGF表達狀況，透射電鏡觀察HSC形態(tài)學變化。 結果： 15-d-PGJ<,2>和GW7845可顯著抑制HSC中TGF-β1誘導的CTGF表達(同時在轉錄和轉錄后水平)，且PPARγ配體對CTGF表達的抑制作用可被GW9662部分或完全逆轉，說明此

11、種抑制效應確由PPARγ所介導；電鏡觀察亦顯示HSC由活化態(tài)向靜息態(tài)的形態(tài)學轉變。 結論： PPARγ活化可顯著抑制HSC中TGF-β1誘導的CTGF表達，提示PPARγ可作為逆轉肝纖維化治療的新的有效靶點。 總之，本實驗證實PPARV配體可顯著抑制HSC生長及TGF-β1誘導的CTGF表達。由于HSC增殖、活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵事件，且CTGF又是調控ECM產生沉積的關鍵因子，因而PPARγ可能作為逆轉肝