H3N2亞型豬流感病毒10個(gè)基因的原核表達(dá)及抗HA蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立.pdf

1、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科，A型流感病毒屬。流感病毒有A、B、C三種型，它們均能夠感染豬，引起豬流感(Swine influenza，SI)的發(fā)生。豬流感是豬的一種急性的呼吸道傳染病，其特征為高熱、突發(fā)、流鼻涕、精神沉郁、呼吸困難、體重下降、衰竭、咳嗽、反復(fù)發(fā)作等。目前發(fā)現(xiàn)的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H5N2

2、、H4N6、H5N1和H9N2共11種不同的亞型。根據(jù)血清學(xué)、病原學(xué)以及流行病學(xué)的研究，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的亞型有H9N2、H5N1、H3N2、H1N2和H1N1，以H3N2和H1N1亞型的流行及危害相對(duì)比較嚴(yán)重。在我國(guó)的豬群中，長(zhǎng)期存在著這些小同亞型的流感病毒，為病毒的基因重排創(chuàng)造了條件，這必將對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)和人類的公共衛(wèi)生等產(chǎn)生潛在的威脅。國(guó)際學(xué)術(shù)界現(xiàn)在已經(jīng)普遍認(rèn)為，在人群中有流行潛力的流感病毒株可以通過(guò)豬產(chǎn)生。因此豬流感的影響不僅在其對(duì)于獸

3、醫(yī)流行病學(xué)的意義，更在于其所產(chǎn)生的深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生意義。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室分離得到的A/swine/Henan/1/2010(H3N2)豬流感病毒及其全基因測(cè)序質(zhì)粒和測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，利用DNAStar5.0等軟件對(duì)所要表達(dá)的HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB2基岡進(jìn)行分析，采用DNAStar5.0和Primer Premier5.0軟件，根據(jù)各基因主要的抗原區(qū)域設(shè)計(jì)了11對(duì)引物（針對(duì)M2基因設(shè)計(jì)了2

4、對(duì)），通過(guò)PCR(M2基因采用的是OE-PCR)的方法分別對(duì)其進(jìn)行了克隆，繼而與pET-28a(+)或pET-32a(+)構(gòu)建相應(yīng)的重組表達(dá)載體并在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)，為H3N2亞型SIV亞單位疫苗的開發(fā)以及下一步單抗的特異性鑒定打下基礎(chǔ)。
　　采用豬流感病毒(SIV) H3N2亞型A/swine/Henan/1/2010(H3N2)毒株作為免疫原，免疫6周齡的BALB/c雌鼠，取小白鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞NS0融合，以全病毒包被酶

5、聯(lián)反應(yīng)板，間接ELISA方法篩選，經(jīng)過(guò)3次有限稀釋法克隆，最終得到1株能穩(wěn)定分泌抗H3N2單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為1C10。經(jīng)檢測(cè)，小鼠腹水抗體效價(jià)為1∶51200;間接免疫熒光說(shuō)明其能與抗原特異性結(jié)合。交叉性試驗(yàn)結(jié)果表明，該單抗小與H1、H5、PRRS、PCV2、PPV發(fā)生交叉反應(yīng)。以H3N2的10個(gè)蛋白為抗原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，間接ELISA的結(jié)果表明，該單抗特異性識(shí)別H3N2血凝素(HA)蛋白，表明原核表達(dá)的H3N2 HA