甘草黃酮抗硫代乙酰胺誘導大鼠肝纖維化的作用以及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化（Hepatic Fibrosis，HF）是肝臟對各種損傷因子的創(chuàng)傷愈合反應，以細胞外基質(zhì)(Extra Celluar matrix，ECM)過度沉積為病理特征，是各種慢性肝病共有的病理過程。大量的動物實驗和臨床實驗研究表明，肝纖維化是一個可逆轉(zhuǎn)的病理過程。然而，目前臨床上缺乏確切有效的抗肝纖維化藥物及治療方法。所以，尋找有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物是目前保肝藥物研究的熱點。而我國中草藥在抗肝纖維化療效方面具有良

2、好的藥理活性。
　　甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）入藥已有悠久歷史。早在二千多年前，《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其列為藥之上乘。南朝醫(yī)學家陶弘景將甘草尊為“國老”，并言：“此草最為眾藥之王，經(jīng)方少有不用者”?！皣稀?，即帝師之稱。把甘草推崇為藥之“帝師”，其原因正如李時珍在《本草綱目》中所釋：“諸藥中甘草為君，治七十二種乳石毒，解一千二百草木毒，調(diào)和眾藥有功，故有‘國老’之號”。現(xiàn)代中醫(yī)認為，甘草性平，味甘

3、，歸十二經(jīng)，有解毒等諸多藥理作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，甘草及其富含的活性成分具有保肝和抗肝纖維化的作用。
　　寧夏甘草的栽培技術已獲成功，種植面積達5萬余畝。在形成圍欄保護面積達40萬余畝的豐富資源優(yōu)勢同時，一方面，對寧夏人工栽培甘草在化學成份、質(zhì)量分析方面進行了大量的研究工作；另一方面，結(jié)合產(chǎn)業(yè)化要求，制訂了相關的質(zhì)量標準和（總）黃酮成份的提取工藝標準。
　　本研究根據(jù)以甘草黃酮（Licorice Flavonoids，L

4、F）為研究對象，采用硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)誘導的肝纖維化大鼠為實驗模型，明確甘草黃酮的抗肝纖維化作用，研究其保肝作用相關分子機制的同時，以期為甘草的開發(fā)、利用提供可靠的藥理學研究。
　　實驗目的：
　　1.復制硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化動物模型，通過血液生化法、組織病理學方法，觀察肝功能相關生化指標、肝纖維化相關病理指標，研究甘草黃酮對實驗動物肝纖維化的干預作用；
　　2.通過分子生物學方法

5、觀察甘草黃酮對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和半胱天冬酶-3（Caspase-3）蛋白表達水平及TGF-β1的mRNA水平的影響，探討甘草黃酮抗肝纖維化的可能作用機理。
　　實驗方法：
　　將84只雄性SD大鼠，隨機分為7組。模型組給予腹腔注射（ip）硫代乙酰胺（150mg/kg），每周2次，連續(xù)12周復制肝纖維化模型；陰性對照組給予正常的飼養(yǎng)，同法給予生理鹽水；陽性對照組給予硫代乙酰胺的同時，給予的水飛薊素(silym

6、arin;30mg/kg)，灌胃給藥進行干預；甘草黃酮各組在給予硫代乙酰胺同時，給予不同劑量（50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）的甘草黃酮進行干預。第12周末大鼠禁食不禁水12小時。稱重后，行45mg/kg戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)ip麻醉，心尖取血，分離血清。采用生化法檢測血清中ALT、AST、ALP、HA的含量，肝組織中HYP的含量；HE、Masson染色觀察肝纖

7、維化的形成以及免疫組織化學法測量TGF-β1和Caspase-3蛋白含量，qRT-PCR方法檢測TGF-β1的mRNA表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.肝功能及肝纖維化相關的生化指標結(jié)果：
　?。?）硫代乙酰胺誘導的模型組與正常對照組相比，血清中AST、ALT、ALP、HA、以及肝組織中HYP的活性明顯升高。說明肝纖維化形成，肝功能受損，模型成功建立；
　?。?）甘草黃酮各組與水飛薊素干預組血清中AST、ALT、A

8、LP、HA及肝組織中HYP含量較模型組顯著降低（P<0.01），說明甘草黃酮及水飛薊素在本次實驗條件下，具有對抗硫代乙酰胺誘導大鼠肝纖維化的形成、保護肝功能的作用。
　　2.HE染色結(jié)果：
　?。?）在大體觀察下，模型組大鼠肝臟體積增大，重量增加。表面不光滑，有大小不等的顆粒狀外觀，并出現(xiàn)周圍組織廣泛粘連。說明肝纖維化造模成功；
　?。?）鏡下HE染色觀察，模型組肝小葉結(jié)構紊亂，中央靜脈周圍的肝細胞變性，周邊肝細胞脂肪

9、變，間質(zhì)細胞大量彌漫增生。說明纖維組織增生明顯，形成肝纖維化，造模成功；
　?。?）甘草黃酮各組及水飛薊素組與模型組比較，肝纖維化形成得到明顯抑制，顯示較好的干預效果。且甘草黃酮400mg/kg劑量組與水飛薊素組優(yōu)于其他各組。說明甘草黃酮具有對抗硫代乙酰胺誘導大鼠肝纖維化的形成、保護肝功能的作用。
　　3.Masson染色結(jié)果：
　　（1）模型組匯管區(qū)見大量膠原纖維產(chǎn)生，膠原纖維構成的纖維間隔形成，肝臟組織膠原纖維增生

10、程度與正常對照組比較明顯增多(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮400mg/kg組與模型組相比肝組織肝小葉結(jié)構完整，肝細胞變性壞死和纖維組織增生程度明顯減輕（P<0.05，P<0.01），甘草黃酮400mg/kg組療效要優(yōu)于其他各組。說明甘草黃酮具有對抗硫代乙酰胺誘導大鼠肝纖維化的形成、保護肝功能的作用；
　?。?）水飛薊素組膠原纖維的形成程度與模型組相比較顯著降低（P<0.05），且甘草黃酮的作用與水飛薊素的作用相當（P

11、>0.05）。
　　4.對肝臟TGF-β1蛋白表達的影響：
　?。?）TGF-β1蛋白在正常肝組織中僅弱表達；
　　（2）模型組較正常組TGF-β1蛋白表達明顯增多(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮各組TGF-β1蛋白的表達較模型組明顯減少(P<0.01)，甘草黃酮400mg/kg劑量組作用最為明顯(P<0.01)；
　　（4）水飛薊素組大鼠肝臟TGF-β1蛋白表達較模型組明顯降低(P<0.01)；甘草

12、黃酮組與水飛薊素組相比較沒有差別（P>0.05）。
　　5.對肝臟Caspase-3蛋白表達的影響：
　　（1）模型組Caspase-3蛋白的表達較正常對照組明顯增高(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮各組及水飛薊素組Caspase-3蛋白表達較模型組明顯減少(P<0.01)，甘草黃酮400 mg/kg劑量組作用最為明顯；甘草黃酮組與水飛薊素組比較沒差別（P>0.05）。
　　6.對TGF-β1的mRNA表達的

13、影響：
　?。?）模型組TGF-β1的mRNA的表達較正常對照組比較明顯升高(P<0.01)；
　?。?）甘草黃酮組TGF-β1的mRNA的表達較模型組明顯降低(P<0.01)，甘草黃酮400 mg/kg劑量組作用最為明顯；
　　（3）水飛薊素組TGF-β1的mRNA的表達較模型組明顯降低(P<0.01)。甘草黃酮組與水飛薊素組比較沒差別（P>0.05）
　　實驗結(jié)論：
　　1.甘草黃酮具有抗硫代乙酰胺誘導