水林佳對硫代乙酰胺所致的比格犬肝纖維化的保護作用及對Smad3信號通路的影響.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是由于內(nèi)源和外源性的致病因素長期作用于肝臟導致的結果，如病毒、細菌及寄生蟲感染；膽管阻塞；某些化學藥物、毒物以及脂滴的沉積等，這些都可導致肝纖維化?；罨母涡菭罴毎╤epatic stellate cell，HSC）能夠產(chǎn)生遠超出處于穩(wěn)定狀態(tài)時的大量的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，這是導致肝纖維化的最直接途徑，其導致肝臟瘢痕形成，最終形成肝硬化甚至肝癌，危害人類健康。

2、r>　　影響HSC活化的信號轉(zhuǎn)導通路中與之關系最為密切的是Smad信號通路，而Smad3是該通路承上啟下的關鍵分子，在HSC活化過程中起著重要作用。導師前期研究發(fā)現(xiàn)Smad3介導的信號通路在實驗動物的大鼠肝纖維化形成過程中起重要作用；下調(diào)Smad3的表達，在肝組織中的ECM沉積量顯著降低。
　　目前研究認為抑制HSC的活化，能夠逆轉(zhuǎn)肝纖維化。水林佳是一種經(jīng)典的肝損傷修復藥物，它的主要成分是水飛薊賓（silybin），該物質(zhì)具有很強

3、的清除氧自由基、減輕過氧化反應的作用，提高肝臟解毒能力，穩(wěn)定、保護肝細胞膜，加快肝細胞修復、再生及具有抗肝纖維化的作用。但是水林佳對于肝纖維化的作用機制是否有Smad3信號通路參與的報道少見。
　　為此本課題以硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）構建比格犬肝纖維化模型，再給予水林佳懸液灌胃治療，探討水林佳對肝纖維化的保護作用及是否通過Smad3信號通路發(fā)揮作用。
　　目的：
　　明確水林佳對TAA所致的比格

4、犬肝纖維化是否具有保護作用，且該作用是否通過Smad3信號通路實現(xiàn)的。
　　方法：
　　健康、雄性比格犬18只，隨機分成3組，每組6只。正常組：正常飼養(yǎng)12周。模型組：TAA皮下注射12mg/kg，2次/周，持續(xù)12周。TAA+水林佳組：TAA皮下注射12mg/kg，2次/周，持續(xù)12周，從第5周開始同時水林佳懸液灌胃每只28mg/kg/d。12周末，三組動物均靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，取各只犬相同肝葉的肝組織用中性甲醛保存

5、。選HE染色觀察三組比格犬肝組織的病變程度；Masson染色觀察比較三組的纖維膠原含量變化；選免疫組織化學染色方法用于觀察比較三組比格犬肝組織的α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、I型膠原（Collagen I）及Smad3的表達和分布。
　　結果：
　　1. HE染色結果
　　在正常組肝組織中可見有完整的肝小葉結構，肝細胞整齊有序的排列，細胞的大小均一，胞漿飽滿。模型

6、組的肝組織中則觀察到肝小葉結構不清，肝索結構紊亂，呈不規(guī)則排列，肝細胞變性壞死，可見大量粗壯的膠原纖維延伸，周圍充滿大量的炎性細胞。TAA＋水林佳組病變明顯比模型組減輕，但仍比正常組嚴重。
　　2. Masson染色結果
　　模型組與正常組相比膠原纖維明顯增粗變多，染色呈藍色，伸入肝小葉中，膠原面積百分比明顯增高（12.77?0.43 vs0.30?0.02，P＜0.01）；TAA＋水林佳組中膠原纖維明顯減少，膠原面積百分比

7、低于模型組（4.68?0.22 vs12.77?0.43，P＜0.01），但高于正常組（4.68?0.22 vs0.30?0.02，P＜0.01），以上差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　3.肝臟組織免疫組織化學染色結果免疫組織化學染色結果判定：以圖像中棕黃色、黃色染色部分為陽性表達。
　　3.1.α-SMA的表達：正常組僅在肝組織匯管區(qū)少量表達；模型組在匯管區(qū)及纖維條索處可見其表達增多，呈棕黃色；TAA＋水林佳組表達減少，呈淺黃色

8、，比正常組病變加重。
　　3.2.CollagenI的表達：正常組僅表達在血管壁、膽管壁，呈淺黃的細絲狀；模型組在匯管區(qū)、纖維條索等部位可見大量棕黃色的粗條狀纖維；TAA＋水林佳組陽性表達較模型組少，但比正常組表達增多。
　　3.3.Smad3的表達：正常組中僅在肝竇及其周圍的肝細胞胞漿中表達，呈淺黃色；模型組在匯管區(qū)、肝竇和肝細胞中有大量的棕黃色顆粒；TAA＋水林佳組較模型組表達明顯減少、染色減弱，但仍比正常組的染色部分增

9、多。
　　對以上圖像做半定量分析，結果顯示：模型組中的α-SMA、CollagenI及Smad3的表達量均明顯高于正常組（15.93±1.59vs1.52±0.17；20.19±0.15 vs0.41±0.02；6.69±0.23 vs0.90±0.09，P＜0.01）；在TAA+水林佳組中，以上指標的表達量均低于模型組（5.39±0.31 vs15.93±1.59；5.04±0.09 vs20.19±0.15；2.34±0.31