甘草甜素在肝纖維化中作用機制的研究.pdf

1、背景和目的：肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)過程，它產(chǎn)生的病理學基礎是肝細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的生成和降解失衡，致使細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生及在肝臟的異常沉積。研究證實肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)是產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的主要來源，肝臟受到損傷因素的刺激后激活肝星狀細胞，導致細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生。肝星狀細胞的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，該細胞的活化是肝纖維化最終的共同通

2、路。這是我們選擇肝星狀細胞作為研究肝纖維化靶細胞的理論基礎。本實驗所選藥物甘草甜素(Glycyrrhizin)是甘草根莖的提取物，它是甘草次酸和葡萄糖醛酸的共軛化合物，具有抗損傷和抗病毒等多種作用，在臨床用于肝臟方面的治療已有二十余年。近來研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素在肝纖維化的防治中也同樣具有顯著療效。甘草甜素雖然通過不同的的機制及途徑在肝纖維化中發(fā)揮效用，但它抗肝纖維化的細胞學和分子生物學機制仍然未很好的闡明。 為進一步探討甘草甜素在肝

3、纖維化中作用的細胞學和分子生物學機制，本實驗通過用四唑鹽比色實驗法(MTTassay)探討甘草甜素對肝星狀細胞增殖的影響；利用抑制性消減雜交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建甘草甜素處理后的肝星狀細胞靶基因的cDNA消減文庫及篩選肝星狀細胞的靶基因，旨在從細胞學和分子生物學角度探討甘草甜素在肝纖維化中的作用機制，為甘草甜素在肝纖維化的應用提供新的理論依據(jù)。 方法：1.甘草甜

4、素處理肝星狀細胞，通過顯微鏡觀察甘草甜素對體外培養(yǎng)肝星狀細胞生長狀態(tài)、細胞形態(tài)學影響，并繪出生長曲線；同時用四唑鹽比色實驗(MTT法)了解甘草甜素對肝星狀細胞的增殖影響的量效關(guān)系。 2.以甘草甜素處理的肝星狀細胞作為實驗組，未用甘草甜素作用的相同細胞系作為對照組；24h后制備細胞裂解液，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將實驗組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對照組cDNA進行兩次消減雜交及兩次抑

5、制性多聚酶鏈反應(PCR)，將產(chǎn)物與T/A載體連接，構(gòu)建cDNA消減文庫，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α進行文庫擴增，隨機挑選克隆PCR擴增后進行測序及同源性分析。 3.以未用甘草甜素處理的相同細胞系作為實驗組，甘草甜素處理的肝星狀細胞作為對照組；24h后制備細胞裂解液，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切后，將實驗組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對照組cDNA進行兩次消減雜交及兩次抑制性多聚酶鏈反應(PCR

6、)，將產(chǎn)物與T/A載體連接，構(gòu)建cDNA消減文庫，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α進行文庫擴增，隨機挑選克隆PCR擴增后進行測序及同源性分析。 結(jié)果：1.甘草甜素濃度在0.6mmol/L以上時，在體外能抑制肝星狀細胞的增殖，且隨其濃度的增加、作用時間的延長，抑制效果越顯著；甘草甜素亦可引起肝星狀細胞形態(tài)學改變。 2.成功構(gòu)建甘草甜素處理的肝星狀細胞上調(diào)基因的差異表達cDNA消減文庫。文庫擴增后得到36個陽性克隆，進行菌落PCR分析

7、，均得到200-1000bp插入片段。隨機選擇20個克隆，對插入片段隆進行測序，并通過生物信息學分析篩選出12個已知上調(diào)基因序列。 3.成功構(gòu)建甘草甜素處理的肝星狀細胞下調(diào)基因的差異表達cDNA消減文庫。文庫擴增后得到15個陽性克隆，進行菌落PCR分析，均得到200-1000bp插入片段。隨機選擇10個克隆，對插入片段隆進行測序，并通過生物信息學分析篩選出4個已知下調(diào)基因序列。 結(jié)論：1.甘草甜素對肝星狀細胞的增殖具有抑

8、制作用，而且具有劑量、時間效應。抑制肝星狀細胞的增殖可能是甘草甜素的抗肝纖維化作用機制之一。 2.證實甘草甜素可上調(diào)肝星狀細胞已知基因的表達，其中篩選到的上調(diào)基因鐵蛋白重鏈(ferritin，heavypolypeptide)、透明質(zhì)酸介導的細胞運動受體(receptorforhyaluronan-mediatedmotility，RHAMM)、β-胡蘿卜素-15，15'-雙加氧酶(beta-carotene15，15'-dio

9、xygenase)可通過不同的機制抑制肝星狀細胞的增殖，鐵蛋白重鏈還具有抗氧化應激作用而保護細胞免受氧化損傷。推測甘草甜素可促使以上基因表達增強而抑制肝星狀細胞的增殖，減輕氧化損傷從而使肝纖維化好轉(zhuǎn)或逆轉(zhuǎn)。 3.甘草甜素同時可下調(diào)肝星狀細胞的相關(guān)基因，其中DNA損傷結(jié)合蛋白1(damage-specificDNAbindingprotein1，Ddb1)、Toll/interleukin-1樣受體3(Toll/interleuk