E-cadherin在急性噪聲損傷中的分子機(jī)制研究.pdf

1、E-cadherin蛋白(CDH1)是一種鈣依賴性的上皮細(xì)胞間的粘附蛋白,在耳蝸感覺細(xì)胞和支持細(xì)胞中幾乎均有表達(dá)。它在Corti器的發(fā)育和結(jié)構(gòu)及功能的維持中有重要作用。前期研究表明噪聲暴露后E-cadherin在大鼠耳蝸感覺上皮組織中的表達(dá)量增加。但目前還不清楚噪聲暴露導(dǎo)致E-cadherin的增加是由Corti氏器中的哪種細(xì)胞引起的以及其表達(dá)量增加的作用是什么。因此,有必要對E-cadherin在噪聲損傷中的作用作進(jìn)一步深入研究。本研

2、究綜合運(yùn)用誘導(dǎo)性條件基因敲除,顯微分離,激光共聚焦,免疫透射電鏡等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù),探索E-cadherin分子在急性噪聲損傷中的作用。實(shí)驗(yàn)分為以下三個部分:
　　第一部分:E-cadherin條件轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是獲得僅在內(nèi)外毛細(xì)胞或外毛細(xì)胞中將E-cadherin基因敲除的條件轉(zhuǎn)基因敲除小鼠。通過應(yīng)用Cre/loxP技術(shù),將B6.129-Cdh1tm2Kem/J小鼠與Tg(Atoh1-cre/

3、Esr1*)14Fsh/J小鼠和Prestin-CreERT2小鼠進(jìn)行雜交配對和篩選。上述兩種Cre小鼠為誘導(dǎo)性的Cre系統(tǒng),只有與Tamoxifen相結(jié)合時才能啟動Cre重組酶的活性。因此通過藥物誘導(dǎo)可以對E-cadherin基因的敲除實(shí)現(xiàn)時間和空間兩個方面的控制。本實(shí)驗(yàn)中首先將配對后所得的兩種條件轉(zhuǎn)基因小鼠:Cdh1-loxP/Atoh1-cre小鼠和Cdh1-loxP/Prestin-CreERT2小鼠進(jìn)行基因分型,初步篩選獲得基

4、因型Cdh1-loxP為純和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。同時進(jìn)一步通過免疫熒光組織染色法檢測所得小鼠在Tamoxifen誘導(dǎo)后Cre重組酶的表達(dá)活性,判斷小鼠的Cre/loxP重組酶是否工作正常。最后使用腦干誘發(fā)電位法對條件轉(zhuǎn)基因小鼠的聽力水平進(jìn)行檢測,為下一步噪聲暴露實(shí)驗(yàn)提供聽閾水平的基線。實(shí)驗(yàn)篩選得到了符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的條件轉(zhuǎn)基因小鼠Cdh1-loxP(+/+) Prestin-CreERT2(+/-),為后續(xù)研究噪聲暴露后E-cadheri

5、n在耳蝸內(nèi)的表達(dá)變化和結(jié)構(gòu)改變提供了動物模型。
　　第二部分:高純度內(nèi)耳細(xì)胞顯微分離技術(shù)的建立
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是建立一種樣本中RNA保存完好的毛細(xì)胞富集組織(Hair cell-enriched tissue)的提取方法。耳蝸病變分子生物學(xué)研究的成功依賴于高品質(zhì)耳蝸樣本的收集。由于耳蝸結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,從哺乳動物耳蝸中分離感覺細(xì)胞富集的樣本一直是一個挑戰(zhàn)。本研究采用顯微解剖技術(shù)分離感覺細(xì)胞富集的耳蝸組織樣本,使感覺細(xì)胞的純

6、度顯著提高。同已前方法中獲得的感覺上皮組織相比,新方法制備的樣品中含有了一個相對穩(wěn)定感覺細(xì)胞/支持細(xì)胞的比例,并且樣品中的RNA保存完好。使用該顯微解剖方法,我們能夠收集小鼠耳蝸中分離的三種組織類型:感覺細(xì)胞富集組織,外毛細(xì)胞富集組織和內(nèi)毛細(xì)胞富集組織。所有樣本可以用于相關(guān)的下游分析,包括qRT-PCR,微陣列和RNA測序等。
　　第三部分:E-cadherin在急性噪聲損傷中的分子機(jī)制
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是研究E-cad

7、herin在急性噪聲損傷中圍繞外毛細(xì)胞(OHC)所發(fā)生的變化。分析該分子在外毛細(xì)胞富集組織中RNA轉(zhuǎn)錄水平的改變及在Corti氏器的位置結(jié)構(gòu)變化,初步理解E-cadherin在急性噪聲損傷中的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)利用條件轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究外毛細(xì)胞在cdh1基因被敲除后E-cadherin在網(wǎng)狀層中的變化,使用外毛細(xì)胞富集組織分離方法開展相關(guān)細(xì)胞粘附分子qRT-PCR檢測,應(yīng)用3D重建和免疫透射電鏡技術(shù)觀察網(wǎng)狀層外毛細(xì)胞與Deiters細(xì)胞之間